丙酮酸激酶法检测冰冻红细胞解冻后残留甘油含量研究.doc

丙酮酸激酶法检测冰冻红细胞解冻后残留甘油含量研究 丙酮酸激酶法检测冰冻红细胞解冻后残留 甘油含量研究 794TianjinMedLOct2007,Vol35No10 新技术交流 丙酮酸激酶法检测冰冻红细胞解冻后残留甘油含量研究 刘春燕张孝山李浩泷安蓬蓬刘玉河樊晶李彤彤刘晗王维 关键词红细胞甘油丙酮酸激酶乳酸脱氢酶类 低温冰冻红细胞保存技术是红细胞保存的重要方法之 一 ,通常使用甘油作为红细胞冰冻保护剂.甘油可以通过红 细胞膜使溶液的冰点降低,具有冷冻保护作用,但是甘油对红 细胞又有溶血作用,因此冰冻红细胞在输注前必须去除甘油, 使解冻后的甘油残留量控制在国家规定的标准(?10g/L)C, 以下,才能在输注后获得适当的存活率[21.笔者利用自动生化 分析仪建立了测定甘油含量的甘油激酶偶联丙酮酸激酶和 乳酸脱氢酶法(GK—PK—LDH),该方法测定简便,准确性和精 密度均适合甘油浓度的测定,而且无干扰,报告如下. 1材料与方法 1.1材料(1)主要仪器:自动生化分析仪(AU-400,Olympus), 电子天平(MettlerToledo,ALl04);pH计(MettleToledo. Delta320).(2)试剂:甘油激酶(glycerolkinase,GK)日本东洋 纺绩株式会社生产;三羟甲基氨基甲烷(Tris,分析纯)购自上 海丽珠制药有限公司;ATP购自SIGMA;甘油(分析纯)天津 市大茂化学试剂厂生产;PK,LDH,NADH均购自天津联星生 物技术有限公司.(3)GlK_LDH工作液:每100mLTris-HC1 缓冲液(300mmol/L,pH7.6,25oC)中含1000U/LPK,1000 U几LDH,0.50mmol/LArrP,0.56mmol/LNADH,250U几GK. 冰箱2oC,8oC冷藏保存至少稳定半年以上.(4)甘油标准液: 用称量法精确配制5%(50000mg/L)的甘油储存液,然后根 据需要稀释成各种所需浓度的甘油标准液. 1.2方法 1.2.1测定原理NADH氧化速率与标本中甘油含量成正 比,NADH的最大吸收峰在340nm处,因此在340nm连续 监测吸光度的每分钟下降速率,计算甘油的浓度. 1.2.2测定参数主波长340nm,副波长410nm,试剂量 200IxL,样品量1O. 1.2.3线性测定范围精确配制甘油浓度为50,200,300, 500,800,1000,1400,1600,2000,2500,4000mg/L的标准 液,每个浓度同时测3份取其均值,观察线性测定范围. 1.2.4精密度试验(1)批内不精密度(CV%):取3份不同 浓度的甘油溶液,每个样品同时连续检测2O次,计算均值, 标准差及不精密度.(2)日间不精密度(Cv%):取3份不同浓 度的甘油溶液,每日每份样品连续检测3次,连续1O个工作 日,分别计算均值,标准差和不精密度. 1.2.5回收试验在一份含甘油基础浓度为500mg/L样品 中分别加入40O,600,800,1000,1200mg/L的甘油溶液,每 份标本同时测定3次,以其均值计算回收率. 1.2.6干扰试验参考Fujita等131的方法,用含甘油2异门L的 标准液,分别加入等量不同浓度的血红蛋白溶液,维生素C 溶液,胆红素,制备成含甘油浓度统一为1000mg/L的若干 份样本,每份样本连续测定3次. 1.2.737oC破坏实验取1O套试剂放在37温箱中,每隔 24h后取出1套试剂,分别对3个浓度的甘油进行检测,每 日每份样品连续检测3次,计算结果的准确性和精密度,以 此确定试剂的稳定性. 2结果 2.1线性测定范围甘油浓度在50,4000mg/L线性关系 良好,=0.0048+0.0001,r=0.9982,Plt;0.O1.为甘油浓 度,矿为OD值. 2.2精密度GK—PK—LDH法测得含低,中,高浓度甘油的 标本批内不精密度(CV%)分别为0.75%,O.82%和O.69%.日 间不精密度(CV%)分别为2.92%,2.30%和2.80%. 2.3回收率GK—PK—LDH法测得平均回收率为98.6%. 2.4干扰实验样品中血红蛋白高于1.5g/L或胆红素浓度 在51-229.5Ixmol/L时对GK—PK—LDH法无干扰;样品中维 生素C浓度在0.02,3g/L时亦无干扰. 2.537破坏实验通过计算结果的准确性和精密度,发 现GK—PK—LDH试剂在37保存直至第8天测定结果稳 定,说明本试剂稳定性好. 3讨论 长期以来在采供血系统一直沿用过碘酸钠氧化滴定法和 GK—GPO—POD}4li去.前者操作繁琐,耗时长,且为指示剂终点滴 定法,结果靠肉眼判断,后者抗干扰性差,试剂不易保存.本文 结果显示,