PCR技术原理及其应用PPT课件.ppt

精选ppt课件2021 以DNA为模板的反应 反应体积：50~100μl 缓冲液 引物 底物：4种dNTP 模板：102~105拷贝 TaqDNA聚合酶 矿物油 四、PCR反应体系 以mRNA为模板的反应（逆转录PCR） 逆转录反应体系 体积：20 μl 缓冲液 底物：4种dNTP 引物：oligo(dT)12~18 模板：RNA 逆转录酶 其他试剂：RNA酶抑制剂， MgCl2.DTT.牛血清白蛋白 PCR反应体系同以DNA模板的反应体系 （一）PCR反应成分 （1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 （2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过低影响产量，偏高引起错配和非特异性产物增加，且可增加引物二聚体的产生几率。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 （4）dNTP 20~200μmol/L dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量，但特异性增加 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。 （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 10~50mmol/L Tris-Cl 缓冲液，72℃ 时pH 7.2,调节反应体系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50 mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。 （6） PCR反应的缓冲液 （二）循环参数 （1）变性 94oC~95oC，30-60 s 且最初在加Taq酶之前先于97oC充分变性5~10min （2）退火 50oC~55oC，60-90 s 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合; 降低温度可增加反应的灵敏性。 （3）延伸 70oC~74oC，60-120 s 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次 次数过多：非特异扩增增加 （三）PCR产物的积累规律 在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。 多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。 PCR产物的积累规律示意图 （一）一般原则 ①引物长度在15～30碱基。引物过短，会使特异性降低。过长会提高相应的退火温度，且合成引物的成本增加。 ②引物中碱基的分布是随机的，避免4个以上的嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量宜在 45～55％左右。 五、PCR引物的设计 ③避免两引物间的互补，特别是3‘端互补，以免形成二聚体。 ④引物自身不应存在连续超过3bp的互补序列， 否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变性。 ⑤引物的3’端不能有任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。 ⑥引物的5’端限定着PCR产物的长度，可根据产物的要求不同， 可以选用不同的引物修饰法。 ⑦引物与非扩增序列的同源性不应超过70％。 直接提交模板序列到特定网页。 如：/cgi-bin/SGD/web-primer; / 引物设计软件。功能：首先是引物分析评价功能，其中以“Oligo 6”最为优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同。 （二）引物设计的方法 六、PCR产物的检测 （一）琼脂糖凝胶电泳 是PCR扩增产物的分离、纯化和鉴定最常用的方法。其分辨率很高，可测出1ng DNA。一般800bp以上的片段用0.8%的胶，800bp以下的片段