06 生物化学实验--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量.doc

SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量 【目 的】 1 ．掌握 SDS测定蛋白质分子量的操作方法。 2 ．熟悉 SDS测定蛋白质分子量的原理。 【原 理】 带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。不同蛋白质分子具有不同的大小、形状，在一定的 pH 环境中带有不同的电荷量，因而在一定的电场中所受的电场引力及介质对其的阻力不同，二者的作用结果使不同蛋白质分子在介质中以不同的速率移动，经过一定的时间后得以分离，这就是电泳分离蛋白质及核酸生物大分子的基本原理。聚丙烯酰胺凝胶电泳就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关，为了使其只与蛋白质分子的大小有关，从而利用蛋白质在介质中的迁移率来测定蛋白质的分子量，就需要消除蛋白质分子的形状和所带电荷量的不同对迁移率的影响或减小到可忽略不计的程度。 SDS 是十二烷基硫酸钠（ sAium dAecyl sulfate ）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4 g SDS/ 1 g 蛋白质），使各种蛋白质 -SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。 SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。 SDS- 蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样（约为 18? ，即 1.8 nm ），而长轴则随蛋白质分子量成正比的变化。说明， SDS 和蛋白质的结合所形成的 SDS- 蛋白质复合物消除了由于天然蛋白质形状不同而对电泳迁移率的影响。 因此，由于 SDS 与蛋白质的结合，消除了蛋白质所带静电荷的多少和分子形状的不同对电泳迁移率的影响，使其迁移率在外界条件固定的情况下，只取决于蛋白质分子量大小一个因素，而且当蛋白质分子量在 15kD ～ 200kD 之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系，符合下列方程式： Lg MW ＝ － b m R ＋ k 式中 MW 为蛋白质分子量。 m R 为相对迁移率， k 为截距， b 为斜率。在一定条件下， b 和 k 均为常数。 采用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量简便、快速、重复性好；所需仪器设备廉价，样品蛋白质微量；在分子量为 15kD ～ 200kD 的范围内所测得的结果与用其他方法测得的分子量相比，误差一般不超过 10% ，所以应用非常广泛。 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳作为一种单向电泳技术，按照凝胶电泳系统中的缓冲液、 pH 和凝胶孔径的差异可分为 SDS- 连续系统电泳和 SDS- 不连续系统电泳两类；按照所制成的凝胶形状和电泳方式又可分为 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶垂直柱型电泳和 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳两类。它们分别称为： SDS- 连续系统垂直柱型聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS- 不连续系统垂直柱型聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS- 连续系统垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS- 不连续系统垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳 无论采用哪种，其基本原理都一样，具体操作也大同小异。由于 SDS— 不连续系统具有较强的浓缩效应，因而它的分辨力比 SDS- 连续系统电泳要高一些，所以更为常用。本实验以 SDS- 不连续系统为例进行介绍。 【器 材】 1 ．电泳仪，直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 100mA 2 ．微量加样器 3 ．电泳槽装置 4 ．大号试管和中号试管 5 ． 5ml 注射器和 9 号注射针头 6 ．洗耳球、滤纸条、封口膜等 7 ．大培养皿 【试 剂】 ? 标准蛋白质： 根据待测蛋白质分子量的大小，选择 4 ～ 6 种已知分子量（分为低分子量、中分子量和高分子量）的蛋白质纯品作为标准蛋白质。 2 ．电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液： SDS- 不连续系统 PAGE 的 电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液配制见下表： 浓缩胶 缓冲液 Tris 5.98g 1mol/L HCl 48ml 加蒸馏水至 100ml PH 6.7 凝胶储液 Acr 30.0g Bis 0.8g 加蒸馏水至 100ml 分离胶 缓冲液 Tris 36.3g 1mol/LHCl 48ml 加蒸馏水至 100ml PH 8.9 凝胶储液 Acr 30.0g B