第十一讲目的基因的获得.ppt

第一页，共十八页，2022年，8月28日 目的基因 需要克隆的DNA片段。 编码某种蛋白质 研究某基因结构和功能的关系 研究某基因与疾病的关系 第二页，共十八页，2022年，8月28日 目的基因的获得 PCR 化学合成法 cDNA文库 基因组DNA文库 基因差异表达 第三页，共十八页，2022年，8月28日 1 PCR技术获得目的基因 1.1 已知序列基因的PCR扩增 1.2 RT-PCR 1.3 RACE (cDNA末端的快速扩增) 第四页，共十八页，2022年，8月28日 1.1 已知序列基因的PCR扩增 ⑴引物设计； ⑵引物效果检验和PCR参数确定。 第五页，共十八页，2022年，8月28日 1.2 RT-PCR 原理： 利用逆转录酶能将mRNA逆转录成cDNA的特性，通过合适的引物，将细胞内的mRNA逆转录成cDNA。 然后，通过PCR技术，将痕量的cDNA扩增成大量的双链DNA。 第六页，共十八页，2022年，8月28日 逆转录步骤 cDNA 链合成： 一般利用polyT作为引物，也可用特异性的序列作为引物 G U A A U C C U CAAAAAAAAAAAAAAA Reverse transcriptase mRNA cDNA T T A G G A G TTTTTTTTTTTTTTT 逆转录polyT引物 第七页，共十八页，2022年，8月28日 RT-PCR的优点： ⑴不需要纯化mRNA，总RNA就可以作为合成单链cDNA的模板； ⑵单链cDNA合成后其3‘端要进行同聚物加尾，不会丢失末端的最后几个核酸，可得到相当于mRNA5’末端的比较完整的序列。 第八页，共十八页，2022年，8月28日 1.3 RACE 以mRNA为模板，反转录合成cDNA第一链，然后用PCR技术扩增从某个特定位点到3‘端或到5’端之间的未知核苷酸序列。 这里的3‘端和5’端是针对mRAN而言。 第九页，共十八页，2022年，8月28日 RACE的技术流程 ⑴分析核心区段 经过比对分析，找出同源性较强的序列，然后根据核心序列设计引物。 来源：蛋白质、cDNA 第十页，共十八页，2022年，8月28日 RACE的技术流程 ⑵ 设计简并引物和扩增核心区域 第十一页，共十八页，2022年，8月28日 RACE的技术流程 ⑶ 设计RACE引物并进行3‘RACE和5’RACE 扩增的核心区域克隆和测序后，既获得目的基因中间部分的序列，根据这一序列分别设计RACE引物。 3‘RACE： 上游引物：根据中间核心序列设计 下游引物：oligo（dT） 利用cDNA第一链为模板将cDNA3’端扩增出来 第十二页，共十八页，2022年，8月28日 5‘RACE 下游引物：根据核心序列设计 上游引物： ⑴将mRNA5’端的帽子结构切除，然后利用连接酶接上一段已知序列的寡核苷酸； ⑵特殊的反转录酶在cDNA末端加碱基； ⑶TdT的应用。 第十三页，共十八页，2022年，8月28日