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DNA序列分析;一 Sanger双脱氧链终止法 (chain-terminator method); （一）Sanger双脱氧链终止法原理;（二）双脱氧终止法测序反应体系包括：;Sanger法DNA测序的试剂;（三）测序反应的种类;This figure shows the structure of a dideoxynucleotide (notice the H atom attached to the 3' carbon). Also depicted in this figure are the ingredients for a Sanger reaction. Notice the different lengths of labeled strands produced in this reaction.;This figure is a representation of an acrylamide sequencing gel. Notice that the sequence of the strand of DNA complementary to the sequenced strand is 5' to 3' ACGCCCGAGTAGCCCAGATT while the sequence of the sequenced strand, 5' to 3', is AATCTGGGCTACTCGGGCGT ;（四）测序过程: 1.模板与引物杂交 2.引物的延长和合成阻断 四个试管分别加入 DNA聚合酶 dNTP 标记底物 终止剂不同 ddA ddG ddC ddT 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链 3.电泳 ACGT次序 高压电泳 4.放射自显影得到直读图象;二 DNA片段序列测定的策略;（一）定向测序策略 定向测序策略是从一个大片段DNA的一端开始按顺序进行分析 。传统的方法是用高分辨 率限制酶切图谱确定小片段的排列顺序，然后将小片段亚克隆进合适的克隆载体并进行序列 分析。 ;（二）随机测序战略 随机测序战略又称鸟枪战略(shotgun strategy)，此策略是将人 类基因组DNA用机械方法随机切割成2Kb左右的小片段，把这些DNA片段装入适当载体，建 立亚克隆文库，从中随机挑 取克隆片段。最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列。 ;（三）多路测序战略 多路测序战略(Multiplex method)是鸟枪法的一种发展策略，是通过多个随机克隆同时进行电泳及阅 读，快速分析DNA序列的一种技术。这种方法的复合随机克隆文库来源于相同的基因组DNA。 将 DNA片段克隆到20种不同的质粒载体上，再亚克隆进不同的质粒载体。将来源20个亚克隆库的克隆进行测序。 ;（四）大规模DNA测序的趋势－自动化;1、 克隆筛选 从亚克隆文库中寻找并筛选单一克隆已逐步实现了自动化。 2、模板制备 现有的机器人被用来自动分离DNA并制备适于传统操作程度的测序模板 。特定用途的DNA分离仪也已??用。 3、 测序反应 由于手工测序不能保证所需的再生产能力、高通量和准确的重复性，所以 ，DNA 测序反应的自动化对大规模测序是至关重要的。 ;4、自动放射性自显影阅读机 近几年来，自动化放射性自显影阅读机纷纷 上市，并不断向商业化及科研应用方向发展。  5、自动测序仪 DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化 。;310型全自动遗传分析仪;分析仪器的新发展：;优点：i. 四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间； ii. 可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影； iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。 缺点：无法保留原始记录, 四个反应产物点在一条道上,相互间会发生干扰, 导致读序时分辨率下降。;本章重点掌握的内容 DNA序列分析;一 Sanger双脱氧链终止法 (chain-terminator method); （一）Sanger双脱氧链终止法原理;（二）双脱氧终止法测序反应体系包括：;Sanger法DNA测序的试剂;（三）测序反应的种类;This figure shows the structure of a dideoxynucleotide (notice the H atom attached to the 3' carbon). Also depicted in this figure are the ingredients for a Sanger reaction. Notice