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nf1基因表达产物神经纤维素在正常成年大鼠脑中的分布 nf1是一种常染色体遗传疾病，由神经细胞因异常程度而导致大部分身体系统损伤。发病率为1/。此病的主要特点为外周神经多发性神经纤维瘤以及皮肤的咖啡色素斑。在NF1发病过程中,NF1基因的突变极为关键。NF1基因为一种肿瘤抑制基因,该基因定位于第17号染色体长臂1区1带2亚带(17q11.2),由其编码的蛋白质为神经纤维素(neurofibromin)。神经纤维素参与细胞的生长与分化,其氨基酸序列与哺乳类GTP酶活化蛋白(GTPase activating protein, GAP)家族相似,可加速GTP水解成GDP,从而将细胞原癌基因ras编码的蛋白质p21ras从活化型的三磷酸鸟苷(GTP)结合形式p21ras-GTP转化为失活型的二磷酸鸟苷(GDP)结合形式p21ras-GDP,使原癌基因ras活性下调,从而发挥抑癌作用。 尽管有证据表明NF1基因作为肿瘤抑制基因在控制细胞的生长分化过程中起重要作用,但目前对神经纤维素的作用机制尚不很清楚。如拟研究神经纤维素的功能,必须首先搞清楚神经纤维素在脑组织的表达。目前,关于神经纤维素在成年动物脑组织分布的报道尚少且结果也不尽相同。本研究运用免疫荧光组化法对成年大鼠脑中神经纤维素的分布进行了观察,同时使用了兔抗神经纤维素血清和小鼠抗星形胶质细胞特异性酶—胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体等两种抗体作为一抗,以确定神经纤维素在星形胶质细胞是否表达。 材料和方法 1. zamheni溶液 成年SD雄性大鼠5只,体重200～300 g,用3%戊巴比妥钠(1 ml/kg体重)腹腔内注射麻醉后经升主动脉灌注,固定。先用生理盐水50～100 ml快速冲洗,后用Zamboni液(含2%多聚甲醛和15%苦味酸的0.1 mol/L磷酸缓冲液, pH 7.4)约200 ml灌注50 min。取脑修块,置相同固定液中4℃后固定25 h,然后将脑块浸于含20%蔗糖的0.0l mol/L PB(pH 7.4, 4℃)中至沉底。恒冷箱冠状连续切片,片厚30 μm,每隔-片取1片。 2. 免疫荧光观察 切片经0.0l mol/L PBS(pH 7.4)漂洗5 min×3次,0.3% Triton X-100处理1 h(37℃),再用10%正常山羊血清孵育1 h(37℃)。同前漂洗后,用间接法进行免疫荧光反应:(1) 在含兔抗神经纤维素血清(NF1GRP,1∶80, Santa Cruz)和小鼠抗GFAP单克隆抗体(1∶1200,Chemicon)的稀释液中孵育2 h(37℃);(2) 用PBS洗2次,每次5 min;(3) 在含有FITC标记的山羊抗兔IgG(1∶200,Santa Cruz)和rhodamine标记的山羊抗小鼠IgG(1∶200,Santa Cruz)稀释液中孵育4 h(室温);(4) 切片用PBS清洗后,裱片,干燥后用缓冲甘油封片,荧光显微镜(Nikon UFX-Ⅱ)观察,照相。 替代实验用1∶10正常山羊血清代替一抗,其余步骤同实验组,实验结果为阴性。 神经纤维素阳性细胞 神经纤维素阳性细胞在4号滤色片(波长为490 nm)下发绿色荧光;GFAP反应阳性细胞在3号滤色片(波长为550 nm)下呈红色荧光。本实验观察到神经纤维素在端脑、间脑、脑干和小脑中都有广泛分布(表1,Fig.1),荧光标记物分布在神经细胞的核周质及胞核中,在部分较大的细胞还能见到其突起中也有绿色荧光标记物分布。 在4号滤色片下观察时,可见在大脑皮质中神经纤维素阳性细胞最为密集(Figs.2,3)。海马结构CA1～CA3区、齿状回、丘脑前核群、丘脑内侧核群(Fig.4)、丘脑板内核群、丘脑中线核群及下丘脑室周核、室旁核等处的神经纤维素阳性细胞也比较密集。杏仁核(Fig.5)、视交叉上核、视上核、乳头体上核、顶盖前区、下丘脑前区、下丘脑外侧区、下丘脑后区以及小脑的Purkinje细胞层、颗粒层等部位也有数量较多的神经纤维素阳性标记细胞。此外,尾壳核、屏状核、苍白球、缰内侧核、缰外侧核、外膝状体核、内膝状体核、隔外侧核(Fig.6)、隔内侧核、隔下丘脑核以及下丘脑外侧前核、下丘脑背侧核(Fig.7)、顶盖前区(Fig.8)、三叉神经脊束核、蜗神经背核(Fig.9)、蜗神经腹核、前庭上核、前庭内侧核(Fig.10)、前庭外侧核、巨细胞网状核等部位也有数量不等的神经纤维素阳性细胞分布。 在4号滤色片下观察到的神经纤维素阳性细胞由于其所在脑区的不同,其胞体大小及形态也有所不同。小细胞未能观察到突起,大细胞突起也较少,荧光标记物质在胞浆、胞核及突起中均有分布(Figs.2～11)。转换3号滤色片观察时,可见除大脑皮质中GFAP阳性标记细胞较少外,其余各脑区和