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rp-hplc法测定人血浆中氢氯噻嗪的浓度 氢氯仿是一种含有氯仿的利尿剂。它影响肾小管对电解质的重吸收机制, 直接增加钠和氯离子的等量排泄, 造成体内Na+、水负平衡使细胞外液减少和血容量减少。既而增加血浆肾素的活性、醛固酮的分泌, 致尿中钾离子的流失, 降低血钾从而治疗高血压。本文建立了一种快速测定人血浆中氢氯噻嗪浓度的方法。 1 仪器、试剂和仪器 HPLC系统:岛津LC-10ADVP双泵, 岛津SPD-10AVP检测器, 岛津DGU-14A脱气仪, 天津奥特赛斯AT-330柱温箱, 7125手动进样阀, 浙江大学N2000色谱工作站, SANTAX不间断电源。 梅特勒320pH计;IEC CENTRA-7R冷冻离心机;梅特勒AE电子分析天平;Finnpipette 200, 1000 μL连续可调节加样器;Cole-Parmer 4721-00型多管涡旋器。 氢氯噻嗪对照品、内标氢氟噻嗪对照品购自SIGMA公司 (USP标准) ;乙腈、甲基叔丁基醚均为HPLC级, 美国TEDIA公司生产;磷酸钠, 分析纯, 上海试剂二厂;四甲基氯化铵, 分析纯, 上海试剂一厂;磷酸, 分析纯, 杭州建德化工厂;氢氧化钠, 分析纯, 萧山化学试剂厂。 2 enexc38预柱的结构 色谱柱为岛津Shim-pack VP-ODS色谱柱 (5 μm, 150 mm×4.6 mm) , Phenomenex C18预柱 (4 mm×3.0 mm) ;流动相:水-乙腈 (85∶15) , 水相为pH=4.90的缓冲溶液 (四甲基氯化铵4.8 g、磷酸钠3.6 g溶于1800 mL去离子水中, 以磷酸和氢氧化钠溶液调节pH至4.90) , 流速为1.0 mL·min-1, 检测波长271 nm, 柱温30 ℃, 灵敏度为0.01AUFS。 3 溶液的制备 3.1 配制0.0.0%ml-1的储备液 精密称取氢氯噻嗪对照品0.2500 g, 用甲醇溶解并转移至25 mL量瓶, 用甲醇定容至刻度, 得浓度为10 mg·mL-1的储备液。精密量取储备液适量, 配制成浓度分别为100, 10, 1.0, 0.5, 0.1 μg·mL-1的对照品溶液。 3.2 内标溶液的配制 精密称取氢氟噻嗪对照品适量, 加甲醇溶解定容, 制成2 mg·mL-1的内标储备液, 取此储备液适量, 用甲醇配制成浓度为2, 4 μg·mL-1的内标溶液。 4 方法和结果 4.1 有机约化剂为5%聚甲基苯磺酸盐缓冲液dsc-ms 在10 mL玻璃试管中加入4 μg ·mL-1内标溶液25 μL, N2吹干。将冷冻血浆置于室温条件下使其融化, 涡旋20 s混匀, 精密吸取0.5 mL置于上述玻璃试管中, 涡旋20 s, 加入甲基叔丁基醚5 mL, 涡旋2 min, 3000 r·min-1离心5 min, 吸取上层有机相约4 mL置5 mL玻璃样品瓶中, 40 ℃水浴下N2吹干。加入200 μL流动相重组, 取50 μL进样。 4.2 血样的线性回归分析t 取氢氯噻嗪对照品溶液和内标溶液适量, N2吹干, 依次加入500 μL空白血浆制成浓度分别为2, 5, 50, 100, 200, 300, 400 ng·mL-1的对照品血浆各5份按“4.1”项下方法操作, 以氢氯噻嗪峰面积对内标氢氟噻嗪峰面积的比值 (Y) 对氢氯噻嗪浓度 (X) 用加权最小二乘法 (权重因子1/X) 进行线性回归, 得回归方程: Y=5.142×10-3X-0.0019r=0.9991 结果表明, 在2.0～400.0 ng·mL-1浓度范围内峰面积比与氢氯噻嗪血浆浓度呈良好的线性关系, 最低定量浓度 (S/N=10) 为2.0 ng·mL-1。 4.3 平均加收率和rsd 在同一天内对标准曲线范围内不同浓度氢氯噻嗪对照品血浆各5份进行分析测定, 结果表明, 测定方法的日内平均回收率94.1%～109.0%, RSD均小于10%, 结果见表1;连续5 d对5, 100, 300 ng ·mL-1氢氟噻嗪对照品血浆各5份进行测定, 结果表明, 测定方法的日间平均回收率为100.3%, 108.8%, 103.0%, RSD均小于6%, 结果见表1。 4.4 提取回收率试验 用空白血浆精密配制浓度分别为为5, 100, 300 ng·mL-1的对照品血浆 (n=5) , 按“4.1”项下方法处理, 另取空白血浆按“4.1”项下方法处理, N2吹干前加入和配制对照品血浆相同的氢氯噻嗪对照品溶液, 计录氢氯噻嗪的峰面积, 两者比值即为氢氯噻嗪的提取回收率, 结果见表1。 4.5 溶液稳定性测定 配制浓度分别为5, 100, 300 ng·mL-1的对照品血浆各12份, 置于-20 ℃低温冰箱内冷冻保存, 在30 d内不同