SN_T 4463-2016国境口岸布鲁氏菌荧光PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4463—2016国境口岸布鲁氏菌荧光PCR检测方法Test of Brucellosis with real-time PCR at frontier port2016-03-09 发布2016-10-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸布鲁氏菌荧光PCR检测方法SN/T4463—2016*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029)北京市西城区三里河北街16号（100045)总编室：（010址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张0.5字数10千字2016年8月第第一版　2016年8月第一次印刷印数1—1100*书号：155066·2-30464定价14.00元 SN/T 4463—2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出人境检验检疫局本标准主要起草人：吴忠华、吕沁风、郑伟、罗鹏、徐琦、何蕾、李莉、蔡玉峰、杨永耀。I SN/T4463—2016国境口岸布鲁氏菌荧光PCR检测方法1范围本标准规定了国境口岸布鲁氏菌的荧光PCR检测方法。本标准适用于国境口岸感染布鲁氏菌的人或动物以及被该菌污染的物品的荧光PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。WS269布鲁氏菌病诊断标准3缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）PCR：聚合酶链反应（polymerasechainreaction)4对象4.1疑似感染布鲁氏菌的出入境人员或动物。4.22疑似污染布鲁氏菌的物品。5生物安全要求所有有关布鲁氏菌的实验室操作应按照以下规定执行：大量活菌操作或动物感染实验在生物安全三级（BSL-3或ABSL-3）实验室内进行：一布鲁氏菌标本检测操作在生物安全二级(BSL-2)实验室内进行；布鲁氏菌相关的无感染性的材料操作在生物安全一级（BSL-1)实验室内进行；一布鲁氏菌感染性材料运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。6试剂在实验过程中需要以下试剂：引物和探针：·上游引物 BRF1:5'-caagggcaaggtggaagatt-3';下游引物 BRR1:5'-ctgcgaccgatttgatgttt-3';C·荧光探针 FPBR1:5'-fam-atcgtttccgggtaaagcgtcgcca-P-3';1 SN/T-4463—2016·淬灭探针 QPBR1:5'-cgctttacccggaaacga-Dabcyl-3'。荧光PCR反应组分：10×缓冲液：100mmol/L的Tris-HCl（pH为8.0）、500mmol/LKCl、30%甲酰胺、60 mmol/L MgClz :·dNTPs：每种核苷酸浓度为1mmol/L;Taq酶:75U/μL;蛋白酶K消化液：10mmol/LTris-HCl(PH8.0),10mmol/LEDTA,150mmol/LNaCl,0.5%SDS,100 μg/mL~200 μg/mL蛋白酶K;红细胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,25mmol/LKCl,5mmol/LMgCl2，pH7.5。·7仪器设备在实验过程中需要以下仪器设备：-荧光定量PCR仪；一水浴或者干浴器；一高速台式离心机（≥10000g）；一移液器：量程0.1μL～2.5μL，量程1μL～10μL，量程10μL～100μL，量程100μL~1 000 μL。8检测程序8.1标本的采集8.1.1血液标本：抽取人或动物静脉血3mL～5mL，放人带盖的EDTA抗凝管中，并做好标记送检8.1.2痰液标本：收集新鲜痰液3mL～5mL，取痰前先用3%H202漱口1次及清水漱口3次，用力咳出气管深处真正呼吸道分泌物，而勿混入睡液及鼻咽分泌物。8.1.3动物组织标本：无菌操作取动物的肝、脾组织2g～5g，放人无菌容器中，并标记取样日期及部位。8.1.4土壤或粉末状标本：无菌操作用采样勺取2g～5g标本置于无菌容器中密封保存。8.1.5．物体表面标本：采用无菌生理盐水湿润的无菌拭子擦拭物体表面（以100cm²为宜），放人无菌容器中保存。8.2标本的前处理8.2.1血液标本：无需前处理，可直接用于DNA提取。8.2.2痰液标本：需先用2倍于标本体积的1mol/LNaOH消化，混匀振荡5min～10