核酸序列分析.ppt

测序策略 确证性测序策略：对已知序列的次级 克隆或PCR产物进行鉴定和证实。 未知DNA序列的测定策略 对于较小的目的DNA片段（如小于1KB）,可以直接利用M13mp或质粒系统克隆、测序。 对于数千个碱基的大片段未知序列DNA，乃至数亿个碱基的生物基因组，必须将其切割成适当大小的各个片段（如小于1KB）分别进行次级克隆再进行测序，最后拼接全序列。 2、第二代DNA测序技术 新一代测序技术也称第二代测序技术，使用接头进行高通量的并行PCR和并行测序反应，并结合微流体技术，利用高性能的计算机对大规模的测序数据进行拼接和分析。 商品化的测序平台主要有： 罗氏/454 公司的GS FLX测序平台、 Illumina 公司的Genome Analyzer测序平台 AB I公司的SOL2iD测序平台。 基本原理： 先进行文库制备，即将片段化的基因组DNA两侧连上通用接头；随后运用PCR技术扩增技术来产生几百万个空间固定的DNA簇，这种DNA簇由单个文库片段的多个拷贝组成，称PCR克隆陈列或（称聚合酶克隆），最后进行测序，即测定每个克隆的核苷酸序列。 这些反应能大规模的同时进行，然后对每一步反应所产生的信号进行同时检测，以此来获取测序的数据，经过计算机分析获得完整的DNA序列信息，能实现一次对几百万条DNA分子进行序列测定。 工作流程： 文库制备 DNA簇的产生 测序 边合成边测序 焦磷酸测序技术 连接测序 第二代测序技术不需要进行DNA模板克隆。 第二代测序技术最显著的特征是高通量,一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。 第二代测序技术最大的优势在于其测序通量的持续增长，具有很大的发展潜力。 第二代测序技术并不完美，由于其在测序前要通过PCR手段对待测片段进行扩增，因此增加了测序的错误率。并且其测序结果比较短，更适合重测序，而不太适用于没有基因组序列的全新测序。 第二代测序技术的应用 1.从头测序、重测序和个体基因组测序 2.个体基因组测序和SNP研究 3.转录组及表达谱分析 4.小分子RNA研究 3、第三代DNA测序技术 最近,以单分子DNA进行非PCR的测序为主要特征的第三代DNA测序技术已经出现, 如生物科学公司(BioScience Corporation)的HeliScope单分子测序仪。 第三代测序技术的目标是： 实现人全基因组3分钟的测序时间及5000美元的测序价格。 高通量单分子测序原理 第三代测序技术获重大进展 基因测序乱象多 思考题 1.第一代DNA测序技术的核心技术 A.Sanger的双脱氧链终止法 B.Maxam和Gilbert的化学降解法 C.荧光标记技术 D.PCR技术 E.DNA自动分析技术 2. Sanger双脱氧链终止法使用的链终止物 A. NTP B. dNTP C. ddNTP D. a-32P-dNTP E. a-35S-dNTP 3.不适宜于直接作为第一代测序技术测序的DNA模板 A.双链DNA片段和PCR产物 B.单链DNA片段 C.克隆于质粒载体的DNA片段 D.克隆于真核载体的DNA片段 E.提取的染色质DNA 4.DNA自动化测序技术一般不用到的技术 A.Sanger的双脱氧链终止法 B.Maxam和Gilbert的化学降解法 C.荧光标记技术 D.PCR技术 E.电泳技术 5.不是自动DNA测序仪的主要系统之一 A. 测序反应系统 B. 电泳系统 C. 荧光检测系统 D. 探针荧光标记系统 E. 电脑分析系统 6.要制定一个能够简捷准确的DNA测定方案，一般应考虑 A.DNA片段的大小 B.背景资料 C.实验条件 D.测序目的 E.以上都是 7.第二代测序技术一般不用到 A.双脱氧链终止法 B.文库接头 C.高通量的并行PCR D.高通量的并行测序反应 E.高性能计算机对测序数据进行拼接和分析 7.第二代测序技术一般不用到 A.双脱氧链终止法 B.文库接头 C.高通量的并行PCR D.高通量的并行测序反应 E.高性能计算机对测序数据进行拼接和分析 8.相对于第一代测序技术，新一代测序技术不具有的优点 A.高通量