SN_T 3394-2012马秋波病毒实时荧光RT-PCR检测规程.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3394—2012马秋波病毒实时荧光RT-PCR检测规程Code of detecting machupo virus by real-time fluorescence RT-PCR2013-07-01 实施2012-12-12 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准马秋波病毒实时荧光 RT-PCR检测规程SN/T 3394--2012*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013)北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：(010址 www. . cn中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880X12301/16印张 0.5字数 10 千字2013年6月第一版反2013年6月第一次印刷印数 1—1600*书号：155066·2-25391定价14.00元 SN/T 3394—2012言前本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：姚李四、韩辉、黄恩炯、张晓龙、杨宇、曹晓梅、宋峰林、高博、徐宝梁1 SN/T 3394---2012马秋波病毒实时荧光RT-PCR检测规程1范围本标准规定了国境口岸人出境人员或鼠类携带马秋波病毒的实时荧光RT-PCR快速检测方法，包括检测对象、标本采集和处理、检测程序、结果判定及报告。本标准适用于国境口岸人出境人员或鼠类携带马秋波病毒的分子生物学检测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室　生物安全通用要求WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（2005卫生部）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1马秋波病毒machupo virus属沙粒科，包括8种进化支，基因组为分节段双链RNA，由L（大)和S(小)片段组成，分别编码依赖RNA 的 RNA 聚合酶、锌指蛋白和包膜糖蛋白、核蛋白。1962年首次在玻利维亚发现,故其引起的出血热又名玻利维亚出血热。该病毒由肼抵暮鼠（Calomys callosus，又称白足鼠）携带传播，主要通过鼠的分泌物感染人类。4缩略语下列缩略语适用于本文件。RT-PCR:逆转录聚合酶链式反应Ct值：循环阈值，每个反应管的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数RNA:核糖核酸DEPC:焦碳酸二乙酪FAM:6-羧基-荧光素，一种荧光报告基团BHQ:黑洞淬灭基团5 检测对象疑似感染马秋波病毒的人出境人员以及疑似携带马秋波病毒的鼠。1 SN/T 3394—20126生物安全要求6.1检测工作中的个人防护按照GB19489。6.2实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全3级（BSI-3)实验室的生物安全要求。6.31使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。6.4样本运输应按照可《感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》的相关规定。\仪器和设备7.1荧光定量 PCR仪。7. 2 生物安全柜。7.3普通冰箱。7. 470℃及以下超低温冰箱。7. 5普通台式离心机。7.6高速冷冻离心机（转速可达20000g）7.7涡旋器。7.8微量可调移液器（10 μL、100μL、I000μul.）及配套带被芯吸买。8 试剂8.1标准标本处理液：在新鲜配制的_95mLMEM中加人56℃热灭活30min的胎牛血清2mL、1mL庆大霉素(5 000 μg/mL)、1 ml:两性霍素 B(25o μg,ml.)和 I ml青链索(青霍素 G10 000 U/ml、链霉素 10 000 μg/mL），用 7.5%碳酸氢钠溶液调至 pH7.2。8.2核酸提取试剂：用德国Qiagen 公司QIAanpViral RNA,Kit!8.3实时荧光RT-PCR试剂：用ABI公司的Ag-Path-IDTM(ep RT-PCR Kit!)18.4 DEPC水。8.5实时荧光RT-PCR引物及探针：上游引物 PrimerF（5'-3')ACCCTCAATGATGAAWCAAAGAAAG、下游引物 PrimerR（5"-3"):AAGAGTGTGCTGCKCTGTC 及探针 Probe（5′-3':FAM-RAATCTTCTAAGCCAGACAGT-GAATGC