细胞培养的基本技术.ppt

* 第三十页，共五十七页，2022年，8月28日 * 第三十一页，共五十七页，2022年，8月28日 * 第三十二页，共五十七页，2022年，8月28日 * 第三十三页，共五十七页，2022年，8月28日 * 第三十四页，共五十七页，2022年，8月28日 * 第三十五页，共五十七页，2022年，8月28日 * 培 养 要 点 *合适的胰蛋白酶浓度（通常为0.25%） 合适的消化时间：消化时，待组织块变得较疏松，颜色略白为止（通常为37℃，20-40分钟） 第三十六页，共五十七页，2022年，8月28日 * 常 犯 的 错 误 水浴锅未预热 组织块太大 第三十七页，共五十七页，2022年，8月28日 * 胰蛋白酶消化不足或过度 吹打用力过重 常 犯 的 错 误 第三十八页，共五十七页，2022年，8月28日 * 4.3 传代培养和细胞系的维持 第三十九页，共五十七页，2022年，8月28日 * 传 代 细 胞 培 养 细胞在原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的操作叫传代。为获得稳定的细胞株，或大量的同种细胞，当培养细胞形成致密的单层后需进行传代培养。 63 第四十页，共五十七页，2022年，8月28日 第一页，共五十七页，2022年，8月28日 * 第四章 细胞培养的基本技术 4.1 基本操作技术和要求 第二页，共五十七页，2022年，8月28日 * 培养前准备 制订试验计划和操作程序 准备各种器材物品 培养室和超净台的消毒 0.2%新洁尔灭托洗地面 紫外灯照射30-60分钟 以75%乙醇擦拭无菌操作台面 培养室内的无菌操作 第三页，共五十七页，2022年，8月28日 * 洗手和着装 彻底洗手 以75%乙醇消毒手和前臂 可穿经紫外线照射30min的一般清洁工作服。 无菌培养操作 一切操作都应在火焰近处并经过灼烧进行。 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 培养室内的无菌操作 第四页，共五十七页，2022年，8月28日 * 第五页，共五十七页，2022年，8月28日 * 第六页，共五十七页，2022年，8月28日 * 第七页，共五十七页，2022年，8月28日 * 第八页，共五十七页，2022年，8月28日 * 第九页，共五十七页，2022年，8月28日 * 无菌操作中常犯的错误 吸管、剪刀等碰到其他器皿 第十页，共五十七页，2022年，8月28日 * 无菌操作中常犯的错误 正确的拿管姿势 错误的拿管姿势 拿吸管时手碰到无菌区！ 第十一页，共五十七页，2022年，8月28日 * 无菌操作中常犯的错误 培养基浸湿吸管底部的棉花 第十二页，共五十七页，2022年，8月28日 * 4.2 原代培养 第十三页，共五十七页，2022年，8月28日 * 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。 细 胞 和 组 织 培 养 第十四页，共五十七页，2022年，8月28日 * 计 数 细 胞 细胞数/ml=计数16格×稀释倍数 ×104 第十五页，共五十七页，2022年，8月28日 * 原理： （1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。 （2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。 （3）存活测试之步骤为dye exclusion（染料排除），利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。 第十六页，共五十七页，2022年，8月28日 * 两 个 概 念 原代培养