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热休克蛋白 70 减轻帕金森病细胞模型中 α-突触核蛋白毒性的作用
【摘要】 目的探讨HSP70 在因 α-突触核蛋白过表达或突变所致的帕金森病(PD)
细胞模型中的作用及其机制。方法构建过表达野生型和 PD 相关突变型(A53T)α-
突触核蛋白质粒,转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)细胞后得 PD 细胞模型;
然后在细胞模型中转染表达 HSP70 的质粒。采用免疫印迹检测转染 HSP70 细胞
模型中 α-突触核蛋白表达量的改变;采用 MTT 法检测转染 HSP70 后细胞模型活
力的变化。结果转染 HSP70 后,细胞模型 α-突触核蛋白表达减少,细胞活性增
加。结论 HSP70 通过降低 α-突触核蛋白表达水平对 PD 细胞模型发挥保护作用。
【关键词】 α-突触核蛋白;热休克蛋白 70;过表达
α-突触核蛋白是一种在中枢神经系统突触前表达的可溶性蛋白,具有调节膜稳
定性和神经可塑性等生理功能。近年研究发现,α-突触核蛋白基因过表达或突变
可引起 α-突触核蛋白的错误折叠、有毒蛋白寡聚体和多聚体的形成,使其结构和
功能障碍,从而启动一系列级联反应致多巴胺能系统损伤,最终导致帕金森病
(PD) 。研究认为神经保护剂可能是治疗 PD 的一个新的有效途径,而热休克蛋白
70(HSP70)就是其中之一。HSP70 是分子伴侣家族中的一员,作为一种重要的应激
蛋白,能与 错误折叠的蛋白相互作用,阻止聚集物的形成;除此之外,HSP70 还
有助于错误折叠蛋白的降解 〔1,2 〕。在果蝇及酵母的 PD 模型中发现,HSP70
能减轻 α-突触核蛋白的毒性及其引起的神经细胞凋亡 〔3,4 〕,而 HSP70 抑制 α-
突触核蛋白毒性可能与其能够与 α-突触核蛋白相互作用,阻止 α-突触核蛋白纤
维样聚集,降低α-突触核蛋白表达量有关 〔5,6 〕。为进一步证实 HSP70 在 α-
突触核蛋白所致 PD 的作用,本实验首次在神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)PD 模型
中检测了HSP70 的作用及机制,发现 HSP70 可以通过降低 α-突触核蛋白水平发
挥对 PD 细胞模型的保护作用。
1材料与方法
1.1 实验材料 SH-SY5Y 细胞购自 ATCC 公司;限制性内切酶购自Takara 公
司;QIAprep TIP100 Kit 购自 QIAGEN 公司;人胎脑 cDNA 文库、胎牛血清(FBS)、
Lipofectamine2000 购自 Invitrogen 公司;蛋白酶抑制剂 cocktail 购自 Sigma 公
司;anti-α-synuclein 204 抗体、anti-beta-actin 抗体购自 Santa cruz 公司;聚偏二氟乙
烯(PVDF)膜购自 Millipore 公司。
1.2 方法
1.2.1 质粒构建以人胎脑 cDNA 文库为模板,PCR 获得 α-突触核蛋白可编码
序列(CDS 序列) 以Not Ⅰ和 HindⅢ连接到 pCDNA3.1 真核表达载体中,通过
overlap PCR 方法,构建 A53T 突变体,同样以Not Ⅰ和 HindⅢ连接到 pCDNA3.1
真核表达载体中。按照 QlAprep TIP100 Kit Protocol 抽取并纯化质粒,测序证实。
pCDNA3.1-HSP70 质粒由湘雅二医院肝移植中心李杰群博士惠赠。
1.2.2 细胞培养与转染 SH-SY5Y 细胞采用含 10%FBS 的高糖DMEM 培养液,
置于 37℃,5%CO2 的培养箱培养。转染严格按照 Lipofectamine2000 说明书进行。
用不含 FBS 的DMEM 培养基洗涤细胞 2 次,24 孔细胞培养板每孔加入含 2 μl
Lipofectamine2000 及 0.8 μg 质粒 DNA 、不含 FBS 的DMEM 培养基 500 μl,在
37℃,5%CO2 的培养箱中孵育3 h,改用含 10%FBS 的DMEM 培养基继续孵育
48 h 。
1.2.3 免疫荧光将稳定表达蛋白的 SH-SY5Y 细胞接种到有盖玻片的 24 孔板
中,用含 10% FBS 的DMEM 培养于 37℃、5% CO2 培养箱中 36 h 后,弃去培
养基,3.7% 的多聚甲醛/磷酸缓冲液(PBS)室温下固定 15 min。PBS 洗 2 次,每次
5 min 。0.2% 的TritonX-100/PBS 透化 10 min,PBS 洗 2 次,5%牛血清白蛋白(BSA)
封闭液,室温封闭 30 min 。
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