荧光定量PCR实验指南-2.pdf

荧光定量PCR实验指南-2 2.3TaqmanMGB探针设计介绍 MGB探针的优点： ²MGB探针较短 (14-20bp)，更容易找到所有排序序列的较短片段的保守 区。 ²短片段探针 (14-20bp)加上MGB 后，Tm值将提高10℃，更容易达到荧 光探针Tm值的要求。 ²MGB探针的设计原则 ²探针的5’端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相 连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。 ²用primerexpress软件评价Tm值，Tm值应为65-67℃。 ² 尽量缩短TaqmanMGB探针，但探针长度不少于13bp。 ²尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4个或4个以上 的G重复出现。 ²原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检测到(MGB探针将 不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。因此，在进行 SNP检测时， 为了检测到突变子，即TaqmanMGB不与目的片段杂交，不产生荧光信号， 探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间 1/3 的地方。注意：为了满足上述要求的 4个条件，探针的突变位点可向3’ 端移动，但突变位点至少在离3’端2个碱基的前方(即必须确保探针的 后两个碱基是绝对的保守)，以进行SNP检测。反过来，若要进行同类 检测，找的是保守片段区，探针中不应有突变位点。若探针即便是只 有13个bp,探针仍不完全保守。有几个突变，突变位点也应靠近探针的 5’端，这样，即便是突变，探针也可与目的片段杂交，产生荧光信号。 另一种方法是设计简并探针，也可达到即使是突变，仍可检测到突变。 2.4 实时多重PCR探针的选择： 多重实时 PCR的多种含意有两种：一为选择保守的探针和引物，利用 不同的染料标记探针，在检测时可根据荧光的颜色来判定不同的产物。 另一种为选择保守的引物，扩增不同长度的目的片段，反应中加入SYB RN染料，最后根据不同目的片段的Tm值来判定不同的物品。 多重实时PCR的荧光探针应为同一类型：如同时为Taqman 探针、或同 时为MGB探针、或同时为Beacon 探针。 在多重PCR中，多重PCR的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互 干扰分析: 设计好各对引物和探针后，重新在用DNAstar软件中的Primerselect软 件，打开保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然后两两分别选中 所设计的多重引物或两两分别选中所设计的多重探针后，在“report” 菜单下“primerpairdimers”,分析上下游引物的dimers。弹出的窗口 中就告诉此对引物有多少个dimer，并对此对引物用dG值进行评价(通 常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。 3、影响PCR及荧光PCR的其他因素 引物的设计和选择符合荧光PCR的探针并进行设计对于实时荧光PCR尤 其重要。可以说，不合理的设计意味着绝对的失败。但是，好的设计 并不等于好的实验结果，影响PCR和荧光PCR的因素非常多，下面择其 重要进行介绍。 3.1引物退火温度 引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序 列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。 在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到7 0℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。 设定Tm有几种公式。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。大部分 计算机程序使用近邻分析法——从序列一级结构和相邻碱基的特性预 测引物的杂交稳定性。所有oligo软件会自动计算引物的Tm值。在设置 退火温度时可以如下进行：以低于估算的Tm5℃作为起始的退火温度， 以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体 和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm 值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会由于在循环中使用较低的退火 温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设 定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计 的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩 余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。 3.2引物浓度 引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高 的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度，可以在260 nm （OD260）测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数 （nmol/OD），通