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PCR法获取目的基因第1页/共77页第2页/共77页目 录PCR技术的创建PCR技术的原理 PCR的反应体系和条件PCR的类型和应用PCR法获取目的基因PCR法获取目的基因第3页/共77页DNA， 生命的蓝图PCR法获取目的基因第4页/共77页PCR技术Polymerase Chain Reaction多聚酶链式反应PCR法获取目的基因第5页/共77页一、PCR技术的创建——Kary B. Mullis1.Khorana等1971年提出在体外经DNA变性、与适当引物杂交、再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。2.1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。3.1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。4.1988年，第一台PCR仪问世。5.1989年美国《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。6.1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。PCR法获取目的基因第6页/共77页Kary B. Mullis（1944－）三篇重要论文The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction (Scientific American, 1990,262(4):56-61, 64-5 )Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase (Science,1988,239(4839):487-91 ) Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction (Methods in Enzymology, 1987,155:335-50 )PCR法获取目的基因第7页/共77页DNA聚合酶引物M13噬菌体1977年Sanger的测序技术DNA聚合酶引物引物PCR法获取目的基因94℃第8页/共77页55℃37℃1983年Mullis的构思1983年春夏之交的一个晚上， Mullis开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物去扩增模板DNA 的想法。他开车时,感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成DNA。缺点:DNA聚合酶不能耐受高温，每个循环需额外添加DNA聚合酶。PCR法获取目的基因第9页/共77页1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术Taq../../../jxzl/jxdmt/fenyi/PCR-附件-1.ppt#261,-1,5. PowerPoint 演示文稿 DNA聚合酶（来自于Thermus aquaticus，水生栖热菌 )PCR法获取目的基因第10页/共77页二、 PCR技术的原理 1.PCR技术的原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧核苷酸,耐热性DNA聚合酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环合成DNA，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品经过30次循环,可使基因的拷贝数达到数百万。 PCR法获取目的基因第11页/共77页（1）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物 （2）PCR过程：由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成 ①变性：94℃左右，使双链DNA模板解离成为单链； ②复性：55℃左右，引物与模板DNA单链互补配对结合； ③延伸：72℃左右，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的DNA链 （3）重复“变性--退火--延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。PCR法获取目的基因第12页/共77页复温加热复性变 性2.PCR技术依赖于DNA的变性和复性DNA的变性：加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNADNA的复性（退火）：解除变性的条件后, 变性的单链DNA可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复 PCR法获取目的基因第13页/共77页3.PCR技术的特点1）速度快，灵敏度高：经过30轮循环，理论上目的产物的 扩增量达230个拷贝（109拷贝）2）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键；引物设计的原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，尽可能减少非特异性扩增。3）操作简便易行：只需