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龙源版权所有 hpaXm和hpaXm-IP基因对棉花角斑病菌V8表型及HR的影响作者：王清 张勇跃 孟凡奇 刘志坚 缪卫国来源：《江苏农业科学》2020年第08期 摘要：试验前期通过构建相应敲除载体，采用电转化的方法，分别获得Xanthmonas. citri subsp. malvacearum（简称Xcm）菌株的hpaXm基因缺失突变菌株V8ΔhpaXm和hpaXm-IP基因缺失突变菌株V8ΔhpaXm-IP。通过特殊生长平板及烟草接种试验表明，与V8菌株相比，突变菌株胞外多糖产量以及胞外纤维素酶、脂酶活性不变，V8ΔhpaXm菌株的胞外淀粉酶活性显著降低;3种菌株都不能产生胞外蛋白酶;突变菌株在烟草上形成的坏死斑面积变小。表明hpaXm和hpaXm-IP基因与病菌胞外淀粉酶活性及病菌激发烟草过敏反应的能力有关，与胞外多糖、纤维素酶、蛋白酶和脂酶产生无关。同时预示了hpaXm-IP可能具有牵引HpaXm蛋白泌出的能力，且HpaXm蛋白不是V8菌株中唯一激发烟草HR的活性物质，hpaXm及hpaXm-IP可能会影响V8菌株的致病性，但不是必然的。 关键词：棉花角斑病菌;细菌病害;表型;过敏反应;胞外多糖;胞外酶 中图分类号： S435.621.2+5文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2020）08-0116-04 收稿日期：2019-03-08 基金项目：国家甘薯产业技术体系项目（编号：CARS-10-C-13）;国家自然科学基金（编号31160359）;教育部博士点基金（编号：20124601110004、20104601110004）;国家重大基础研究计划（编号：2011CB111612）;国家农业产业技术体系建设（编号：CARS-34-GW8）。 作者简介：王清（1988—），女，河南项城人，硕士，研究实习员，主要从事植物保护等研究。E-mail：1173823088@。 通信作者：缪卫国，博士，教授，主要从事分子植物病理等研究。E-mail：weiguomiao1105@126.com。 棉花细菌性角斑病是我国最早报道的重要细菌病害，在整个生育期都可侵染棉花，该病害对棉花生长过程造成较大的负面影响[1]。棉花角斑病菌于2006年正式定名为Xanthmonascitri subsp. malvacearum b.nov.nom.nov.（簡称Xcm）[2]，属黄单胞菌属的革兰氏阴性细菌，在含有营养琼脂的培养基平板上，菌落形态为近圆形，颜色逐渐由淡黄色变为蜡黄，边缘完整且微凸[1]。1986年决定病原菌对寄主植物致病性和诱导非寄主及抗病植物过敏性反应（HR）的hrp基因在菜豆晕斑病菌中被首次报道[3-4];1992年，人们从梨火疫病菌中发现由hrpN基因编码的第1个Harpin类蛋白HarpinEa[5]，随后众多由hrp类基因编码的Harpin蛋白相继被克隆表达出来，目前大部分Harpin蛋白可激发烟草HR、异位效应等，且具有促生长等作用[6]，对应编码基因被普遍研究。由于棉花角斑病菌V8小种存在限制性修饰系统，一直未能对其特定基因进行定点突变[7]，因此关于hpaXm、hpaXm-IP基因对V8小种生物学特性和烟草过敏反应的影响暂未见报道。 hpaXm基因是从V8小种XCM143基因组DNA中克隆的全长为402 bp的序列[6]，能编码定位于hrp区域的Harpin类蛋白HpaXm。缪卫国通过信号肽软件Signal 3.0 server对蛋白的二级结构进行预测和GST-HpaXm融合蛋白的表达进行检测，结果显示，HpaXm的N端前15个氨基酸是存在的信号肽，且信号肽缺失后该蛋白不能正常泌出胞外，hpaXm-IP则是编码该信号肽的长为45 bp的基因序列[2]，这预示HpaXm蛋白的泌出方式可能不同于其他Harpin蛋白。本研究将突变菌株V8ΔhpaXm和V8Δhp6aXm-IP进行特殊营养琼脂培养基平板、营养肉汤培养基培养基生长试验以及烟草HR测定，分析hpaXm及hpaXm-IP基因对V8菌株生物学特性及其激发烟草HR能力的影响，以期为后续突变菌株致病性、Harpin蛋白泌出途径及缺失N端45个氨基酸对Harpin蛋白的影响等相关研究提供相关科学参考。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1相关基因hpaxm基因从Xcm基因组中通过PCR扩增获得;hpaXm-IP基因为hpaxm基因中长为45 bp的编码HpaXm蛋白N端类似信号肽序列的一段基因。 1.1.2菌株试验用菌株棉花角斑病菌（Xanthmonas. citri subsp. malvacearum，Xcm）V8菌株（8号小种）从棉花上分离获得，V8ΔhpaXm-IP以hpaxm为靶基因构建敲