凤丹牡丹二氢黄酮醇-4-还原酶基因克隆及表达特性分析-《江苏农业科学》(2020年10期).docx

龙源版权所有 凤丹牡丹二氢黄酮醇-4-还原酶基因克隆及表达特性分析作者：甘林鑫 李厚华 李果 刘鹏远 韩美玲来源：《江苏农业科学》2020年第10期 摘要：以凤丹种皮为材料，克隆花青素生物合成中的关键基因DFR，并进行功能验证。结果表明，凤丹DFR基因含有长度为1 092 bp的开放阅读框（ORF），共编码364个氨基酸。其中，凤丹DFR蛋白的相对分子量为 40 796.17 u，理论等电点（PI）为5.76。实时荧光定量分析凤丹牡丹种子4个发育阶段的PoDFR基因表达水平，结果表明，在凤丹种子发育过程中，PoDFR基因的表达水平先增加后减少，在S2时期达到最高。构建PoDFR基因的原核表达载体并在大肠杆菌中表达以获得PoDFR的原核表达蛋白。体外酶促反应和高效液相色谱法表明，PoDFR蛋白可以催化二氢槲皮素合成无色花青素，通过与PoANS蛋白结合合成花青素，证明PoDFR基因具有相应的功能活性。 关键词：凤丹牡丹;DFR基因;二氢槲皮素;花青素;表达特性;功能 中图分类号： S685.110.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2020）10-0073-07 收稿日期：2019-05-06 基金项目：公益性行业（林业）科研重大专项（编号：201404701）;国家自然科学基金（编号。 作者简介：甘林鑫（1994—），女，云南昆明人，硕士，主要从事园林植物分子生物学研究。E-mail：597807188@。 通信作者：李厚华，博士，教授，主要从事园林植物研究。E-mail：lihouhua73@163.com。 凤丹牡丹，别称铜陵牡丹，栽培历史悠久，因其结实量大，栽培管理方便，已成为油用牡丹的主要品种[1]。然而，在实际生产榨油和使用过程中，由于成熟的牡丹种子外壳呈现黑色（图1），压榨后的原油会出现有异味的黑色物质，降低了牡丹原油的品质，而脱壳又会降低出油量。因此，研究黑色物质合成的相关基因，可以为下一步在基因工程层面上改善凤丹牡丹的种壳特性提供理论依据[2]。研究发现，类黄酮物质是牡丹种壳中的主要色素成分，包含花青素类、黄酮类和原花青素类[3]，DFR基因作为类黄酮合成途径中的关键基因，还未在凤丹牡丹中被克隆。DFR（dihydroflavonol 4-reductase，二氢黄酮醇-4-还原酶）可以催化二氢黄酮醇合成无色的天竺葵素、飞燕草素或矢车菊素，再结合ANS（anthocyanidin synthase）催化合成有色花青素[4-6]。 为了解凤丹牡丹种皮中DFR基因的表达和调控，通过RT-PCR从凤丹牡丹种壳中克隆了类黄酮合成途径的重要基因DFR，并分析该基因的生物学信息。通过原核表达的方法获得该基因翻译的相应蛋白，再进行酶促反应，利用高效液相色谱法验证该基因的功能，分析了凤丹牡丹中类黄酮化合物代谢的分子机制。 1 试验材料与方法 1.1 植物材料与菌株 本试验以凤丹牡丹种子为材料，于西北农林科技大学牡丹种质资源圃中分别采集白色期、变色期、褐色期、黑色期的凤丹种子（图2），在液氮中快速冷冻后，将其储存在-80 ℃冰箱中用于基因克隆及表达分析。 1.2 凤丹总RNA提取与cDNA合成 使用OMEGA Plant Total RNA提取盒进行RNA提取，根据说明书操作。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用外分光光度计检测浓度。以每个时期总RNA为模板，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser，先消除基因组DNA后，反转录合成cDNA第一链，置于-80 ℃备用[7-8]。 1.3 基因克隆 基于NCBI上其他植物的DFR基因序列，使用软件Primer 5.0设计引物（表1）。以逆转录获得的cDNA为模板，用PrimeSTAR HS DNA聚合酶高保真酶扩增靶基因全长，琼脂糖凝胶电泳检测反应结果。 扩增条件为98 ℃预变性1 min;98 ℃变性10 s，58 ℃ 退火5 s，72 ℃延伸1 min（35个循环）;将反应在 72 ℃ 延伸5 min，在4 ℃下储存。在1%琼脂糖凝胶上检测扩增产物，纯化并回收目标条带，把回收产物连接到pGEM-T载体上，通过热击法转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选和菌落PCR验证后，将阳性菌液培养过夜，送至公司进行测序[9-11]。 1.4 生物信息学分析 使用NCBI BLAST进行氨基酸序列的同源分析，利用ExPASyProtParam Tool（http：///protparam/），HNN SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD，Swiss-Model Workplace（http：///）和TMGM