硬叶兜兰菌根结构及菌根真菌空间分布特征-《江苏农业科学》(2019年2期).docx

龙源版权所有 硬叶兜兰菌根结构及菌根真菌空间分布特征作者：田凡 廖小锋 颜凤霞来源：《江苏农业科学》2019年第02期 摘要：为了解濒危植物硬叶兜兰菌根真菌在结构及分布方面的特征，采用切片法观察其菌根结构，分离培养不同根龄菌根真菌、根不同部位的菌根真菌，并进行观察、鉴定。结果表明，硬叶兜兰菌丝团大多数分布于根部皮层细胞，菌丝团数量由外皮层向皮层细胞逐渐增加，皮层细胞向内皮层逐渐减少，内皮层和中柱细胞内没有菌丝和菌丝团;皮层中间部位菌根真菌菌丝团数量最多，高于靠近表皮和靠近中柱部位的菌丝团数量;根基部、中部和根尖部位都有菌根真菌，但根中部的菌根真菌数量最多;菌根真菌的种类和数量随着根龄的变化而变化，随着根龄的增加，菌根真菌种类和数量也相应地增加。 关键词：硬叶兜兰;菌根真菌;菌根结构;分布;特征 中图分类号： Q934 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）02-0105-04 兰科（Orchidaceae Juss.）植物大多数依赖菌根真菌所提供的营养物质来促进种子萌发和幼苗生长[1]。部分具有绿色叶子和无叶绿素的兰科植物，整个生长周期都须要与菌根真菌共生[2]。自20世纪初由Bernard和Burgeff揭示兰科植物菌根之谜后，国内外相继开展了大量的兰科植物菌根真菌的研究。近年来也有一些学者对兜兰属（Paphiopedilum Pfitz.）植物菌根真菌进行了报道，李明等对杏黄兜兰（Paphiopedilum armeniacum S. C. Chen & F. Y. Liu）菌根真菌进行了研究[3];Yuan等利用分子系统学方法，对比了野外与移栽到温室2种不同生境的硬叶兜兰（Paphiopedilum micranthum Tang & F. T. Wang）和杏黄兜兰的菌根真菌多样性[4];Nontachaiyapoom等收集了不同生境的兜兰属植物进行菌株分离，通过形态和分子鉴定出了Epulorhiza repens和Epulorhiza calendulina（均暂无中文名）类真菌[5]。 原产于我国兜兰属的硬叶兜兰，花奇色美，具有非常高的观赏价值[6]。由于采集过度、走私出境猖獗以及生境破坏等原因，近十几年来野生硬叶兜兰的数量急剧减少，分布区逐渐萎缩，已经到了灭绝的边缘。硬叶兜兰野生资源的保护和人工繁育问题亟待引起社会各界的重视。由于硬叶兜兰的种子无胚乳，发芽率极低，虽然目前人工无菌播种已经获得成功，但是出瓶率低、移栽难的问题还没得到解决。将菌根真菌应用于种子萌发及幼苗的生长，可解决硬叶兜兰人工有性繁殖难题。本研究对硬叶兜兰菌根进行切片观察并对其菌根真菌进行分离培养，分析硬叶兜兰菌根结构及菌根真菌空间分布特点，以期为兰科植物内生菌根真菌的特征增添素材，为硬叶兜兰的人工繁殖及其保育工作提供理论基础和实践经验。 1 材料与方法 1.1 试验材料 试验材料为硬叶兜兰成年植株根部，其植株采集于贵州省铜仁地区德江县青龙镇潮水河一带。 1.2 试验方法 1.2.1 徒手切片法 将硬叶兜兰根在流水下冲洗干净，选取具有菌丝团的根段，徒手切片，用乳酸石炭酸棉蓝染色液染色，在OLYTMPUS DP70光学显微镜下观察菌根结构特点并拍照。 1.2.2 菌株的分离培养 菌株分离培养参考Zhu等的单菌丝团分离法[7-8]，具体如下： （1）根处理和含菌丝团根段的选择。截取硬叶兜兰新鲜根段分装于盛有无菌水的培养皿中，无菌状态下用解剖刀轻轻刮掉根被，显微镜检，选出具有菌丝团的根段，用0.1%氯化汞溶液消毒2～3 min，无菌水冲洗 4～5次，然后用解剖针和镊子刮菌丝团根段，使单菌丝团从皮层细胞中游离出来，24 ℃ 恒温箱培养12 h后显微镜观察。 （2）菌丝团的刮制方法。在显微镜下观察，根据第1层（靠近表皮的2～3层细胞）、第2层（中间3～4层皮层细胞）和第3层（靠近中柱2～3层细胞）3个层次分别刮制于盛有无菌水的直径为60 cm培养皿中。 （3）菌丝团的选择及分离培养。在显微镜暗视野中找到生长出菌丝的菌丝团或菌丝结，利用1 000 μL的移液枪吸取菌丝团，转接到1 cm2双抗马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）培养基块上，24 ℃恒温箱培养。 （4）菌丝团的纯化。显微镜下镜检小块培养基，将开始生长的菌丝团从小块培养基上切下，然后转接至PDA培养基，24 ℃恒温培养。 1.2.3 菌株鉴定 菌种鉴定依据菌株菌落的培养特征及菌株显微形态观察的结果，结合文献资料，综合分析对比相关特征的异同，最后确定鉴定菌株的分类地位。 2 结果与分析 2.1 硬叶兜兰菌根结构 显微镜下观察硬叶兜兰根的纵切面和横切面，从外至内依次为根毛（RH）、根被（velamen）、外皮层（exodermis）、皮层（cor