猪丹毒丝菌强毒株与弱毒疫苗株SpaA基因生物信息学分析-《江苏农业科学》(2020年17期).docx

龙源版权所有 猪丹毒丝菌强毒株与弱毒疫苗株SpaA基因生物信息学分析作者：袁晓晴 彭凌 陈锦红 温权 刘博婷 蔡巩林来源：《江苏农业科学》2020年第17期 摘要：对猪丹毒丝菌SpaA蛋白进行生物信息学分析，并对比了猪丹毒丝菌弱毒菌株和野生强毒菌株间的差异。结果显示，由于猪丹毒丝菌GC42的SpaA蛋白缺少一段含有80个氨基酸的序列，使得该菌株的蛋白质相对分子质量、氨基酸组成、二级和三级结构与强毒株的SpaA蛋白质相比均有所差异，导致这2株菌株引发机体产生的免疫原性和抗原性强弱有所不同，推测这2株菌株中，SG7菌株的免疫原性相对GC42较强;GC42菌株的抗原性相对SG7菌株的抗原性来说较弱，而猪丹毒丝菌GC42菌株的毒力相对猪丹毒丝菌SG7菌株较弱，因此呈现弱毒菌株特性;推测2株菌株的氨基酸序列均在193～206、217～231、290～309、313～327、328～376、386～457区段具有较高的形成B细胞表位的可能性。 关键词：猪丹毒丝菌;SpaA蛋白;弱毒菌株;生物信息学分析;B细胞抗原表位 中图分类号： S852.61 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2020）17-0070-06 猪丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）是一种人畜共患传染病的病原菌，人感染后表现为类丹毒症状，猪感染后表现急性或亚急性败血症，这种病原菌广泛分布在各个国家，我国也是猪丹毒流行较广泛的国家之一[1]。猪丹毒是一种自然疫源性疾病，其传染源主要包括病猪和带菌猪的分泌物、排泄物及死猪污染的饲料、饮水、土壤等[2];这不仅对世界各地畜禽养殖业的经济造成了巨大损失，而且还严重危害了人类的健康[3]。目前，已有多种灭活疫苗和弱毒疫苗用于预防猪丹毒的流行，虽然这些疫苗的应用对预防和控制猪丹毒的暴发确实起到一定的积极作用，但由于猪丹毒丝菌有较多的血清型，使得疫苗的免疫保护效果存在严重的局限性，因此研制安全高效的疫苗是目前对控制猪丹毒流行较为有效的手段[4]。 随着生物信息学的快速发展，利用生物信息学软件对所获得的生物信息数据进行分析已是常用的方法[4]。迄今为止，已有很多研究者通过生物信息学的方法对所获得的数据进行分析预测[5]，本研究通过生物信息学相关软件对猪丹毒丝菌强毒、弱毒菌株的表面蛋白抗原A（surfactant proteins antigen A，SpaA）基因序列进行同源性分析及结构域对比，从而对SpaA基因指导的蛋白质一、二、三级结构及B细胞表位进行预测，对比猪丹毒丝菌弱毒菌株和野生强毒菌株之间的差异，试图对弱毒菌株减毒原因进行分析，以期为SpaA蛋白作为猪丹毒丝菌亚单位疫苗的候选抗原提供理论依据，同时也为猪丹毒杆菌SpaA蛋白功能研究提供线索[5]。 1 材料与方法 1.1 菌株 从广东地区分离得到的猪丹毒丝菌野外分离株SG7，经动物试验鉴定为强毒株。猪丹毒丝菌弱毒株GC42，从广西丽原生物股份有限公司的猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联活疫苗中分离得到。 1.2 SpaA基因聚合酶链式反应（PCR）扩增与测序 按照SpaA（EF688017）的基因序列及载体多克隆位点，运用Primer Premier 5.0软件来设计特异性引物的序列，在引物序列的5′端上插入2个酶切位点，分别为BamHⅠ酶切位点与EcoRⅠ酶切位点。上游引物SpaA-1：5′-CGCGGATCCATGAAAAAGAAAAAACACC-3′。下游引物SpaA-2：5′-CCGGAATCCCTATTTTAAACTTCCATCGT-3′。 PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30个循环后，72 ℃延伸7 min。将PCR产物连接载体后再送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。 1.3 猪丹毒丝菌SG7和GC42的SpaA基因的理化性质分析 通过ExPASy服务器来分析猪丹毒丝菌SpaA基因的性质;通过Prot Param来分析蛋白质的氨基酸序列组成、相对分子质量、等电点等物理化学性质;通过SignalP 4.0来预测蛋白质的信号肽。 1.4 猪丹毒丝菌SG7和GC42的SpaA蛋白二级结构预测 通过ExPASy服务器上的SOPMA方案进行预测猪丹毒杆菌SpaA蛋白的二级结构。 1.5 猪丹毒丝菌SG7和GC42的SpaA基因结构域和功能预测 使用NCBI中的CDD（Conserve Domain Database）数据库对猪丹毒丝菌SG7和GC42的SpaA基因序列进行保守结构域分析。 1.6 猪丹毒丝菌SG7和GC42的SpaA蛋白三级结构预测 利用SWISS-MODEL構建猪丹毒丝菌SG7和GC42的Spa