桑树ISSR-PCR反应体系建立及优化-《江苏农业科学》(2020年10期).docx

龙源版权所有 桑树ISSR-PCR反应体系建立及优化作者：刘玲 唐仕成 郑丹 柯皓天 吕银来源：《江苏农业科学》2020年第10期 摘要：采用正交试验设计L16（45）对桑树ISSR-PCR反应体系中的模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和rTaq酶5个因素及反应程序中变性时间、退火时间、延伸时间和循环数进行优化分析。结果表明，各因素水平变化对反应体系的影响大小依次为DNA模板>rTaq酶>Mg2+>引物>dNTPs。最终确立了最佳反应体系，即在10 μL反应体系中，含25 ng/μL DNA模板1 μL、10×PCR buffer 1 μL、20 μmol/L引物0.2 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 0.8 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μL rTaq 0.1 μL。优化得到的反应程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性40 s，合适的退火温度退火45 s，72 ℃ 延伸90 s，40个循环;72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。通过梯度PCR，确定引物ID37的退火温度为49.5 ℃。稳定性检测表明该体系能用于桑树ISSR分析。 关键词：桑树;正交试验设计;ISSR-PCR;反应体系优化 中图分类号：S888.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2020）10-0080-05 收稿日期：2019-05-15 基金项目：四川省科技计划（编号：2019YJ0291）。 作者简介：刘 玲（1989—），女，山西大同人，硕士，工程师，主要从事桑树分子标记工作。E-mail：liuling1022@yeah.net。 桑树是桑科（Moraceae）桑属（Morus L.）多年生木本植物，是重要的经济植物，桑叶是家蚕的主要饲料。我国地域辽阔，生态环境各异，经长期的自然选择和人工选育，形成了非常丰富的桑树种质资源。研究桑树的遗传多样性及其亲缘关系对桑树的栽培育种、良种选育等有重要意义。 简单重复序列间扩增（inter-simple sequence repeat，简称ISSR）标记是一种基于微衛星序列发展起来的分子标记，以PCR技术为基础，利用真核生物基因组中广泛存在的微卫星序列设计引物，对2个距离较近、方向相反的SSR序列之间的基因组片段进行扩增。ISSR分子标记技术结合了RAPD和SSR分子标记的优点，稳定性和重复性好，多态性高。国内外众多研究者已将ISSR分子标记技术应用于桑树种质资源的遗传多样性研究等方面[1]。 本研究参考以往桑树ISSR研究，采用正交设计和极差分析结合的方法，对桑树ISSR-PCR反应体系中的5个因素：模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和rTaq酶，进行4个水平优化，并对反应程序中的变性时间、退火时间、延伸时间和循环次数进行正交设计优化，以期建立适合于桑树ISSR分析的PCR反应体系，为ISSR分子标记在桑树上更广泛地应用提供试验基础。 1 材料与方法 1.1 材料 试验材料采自四川省丝绸科学研究院桑树种质资源圃。选择品种资源“团桑10号”作为PCR反应体系、反应程序和引物退火温度优化的模板。 扩增引物参考由加拿大英属哥伦比亚大学UBC公司2006年公布的ISSR引物序列和已有的ISSR分子标记在桑树方面的应用研究结果[2]，由上海生工生物工程股份有限公司合成。经初步试验，选择扩增片段清晰的引物ID37（5′-GAGGAGGAGGAGGC-3′）作为建立反应体系的固定引物。PCR反应所用的Mg2+、dNTPs、rTaq酶、DNA marker和10×buffer均购自TaKaRa公司。 1.2 基因组DNA提取及质量检测 基因组DNA提取参照CTAB法，从约0.15 g硅胶干燥的嫩桑叶中提取。DNA质量用1%琼脂糖凝胶电泳检测，浓度···试读结束