红曲菌MpigE基因过表达质粒的构建-《福建农业科技》(2020年5期).docx

龙源版权所有 红曲菌MpigE基因过表达质粒的构建作者：郑学海 柳燕 朱锦懋 杨成龙 陈由强 陈建楠来源：《福建农业科技》2020年第05期 摘要：以福建红曲菌MCL为出发菌株，以PSKH质粒为模板克隆PtrpC启动子及TrpC终止子。通过重叠延伸PCR技术融合PtrpC启动子、MpigE（目的）基因、TrpC终止子，获得PMT融合片段。为了验证融合片段PMT的正确性，进行琼脂糖凝胶电泳分析，在2100 bp左右出现单一且清晰的条带。通过EcoR V和Spe I酶切PMT片段，插入带有潮霉素抗性的PSKH质粒的EcoR V和Spe I位点，构建1个红曲菌过表达载体HPMT，大小为7 155 bp。通过构建过表达载体，以期对红曲菌MCL进行改造，获得高产色素低产桔霉素的菌株。 关键词：红曲菌;MpigE基因;质粒;过表达;构建 中图分类号：TS261.3文献标志码：A文章编号：0253-2301（2020）05-0001-11 DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.05.001 Abstract： By taking the MCL of Monascus in Fujian as the original strain， the PtrpC promoter and TrpC terminator were cloned by using the PSKH plasmid as the template. The PMT fusion fragments were obtained by fusing PtrpC promoter， MpigE target gene and TrpC terminator with the overlap-extension PCR technology. In order to verify the correctness of the fusion fragment PMT， the agarose gel electrophoresis analysis was carried out， and a single clear band appeared at about 2，100 bp. The fragment of PMT was digested by EcoR V and Spe I， and the EcoR V and Spe I sites of the PSKH plasmid with hydthromycin resistance were inserted to construct an overexpression vector HPMT of Monascus， with a size of 7 155 bp. By constructing the overexpression vector， the MCL of Monascus was modified， thus to obtain the strain with high yield of pigment and low yield of citrinin. Key words： Monascus; MpigE gene; Plasmid; Overexpression; Construct 紅曲霉是目前世界上唯一生产食用色素的微生物，广泛应用于制醋、制酒、酱油、饮料、腐乳、香肠、肉制品、蜜饯等食品中[1-4]。但自从1995年法国Blance等[5]在红曲霉的发酵过程中发现了桔霉素后，红曲产品的安全性问题引起人们的广泛关注。利用传统的诱变、控制发酵条件等无法从根本上去除红曲发酵过程中的桔霉素，因此，人们逐渐将目光转向构建基因工程菌这一途径[6]。 目前基因的过表达技术在米曲霉、酵母菌等其他真菌中有较多的应用，但在红曲菌中的应用还相对较少。2005年秦丽娜[7]成功构建了酿酒酵母整合表达载体pUPGKAT（包括PGK强启动子、酿酒酵母乙醇脱氢酶基因Ⅰ和CYC1终止子），并将其转入原始菌株YS2△adh2重组菌株，结果表明构建的新菌株乙醇产量较出发菌株提高了8.84%。2009年王斌等[8]构建了米曲霉的重组表达载体pNMA-RML，并转入米曲霉宿主菌A.oryzaeniaD300，得到整合型的阳性转化子A.oryzaeONL。由于红曲的次级代谢产物红曲色素、桔霉素在合成途径上有相关性，具有共同的前体，如果对产红曲色素的相关基因进行过表达可能可以增强红曲产色素支路的代谢力度而降低产桔霉素的代谢力度，从而获得高产色素而低产桔霉素的菌株，达到利用基因工程进行分子育种的目的。目前已有研究表明pigR基因、MpigE基因均与红曲色素的合成具有相关性[9-10]