- 1、本文档共11页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
- 5、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
- 6、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 7、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 8、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
HPLC流动相的配制与使用
HPLC流动相的配制与使用
流动相是影响液相色谱的关键因素。一个理想的液相色谱流动相溶剂
应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混合
液,但是如何配制。选择配制的方法不同,分析结果特别是保留时间,
是会有显著差别的。
高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混合
液,水性溶剂也常用于缓冲液。常因资料上表示的内容和实际的配制
方法不同,而产生流动相的差异,影响了色谱图和分析结果。一般来
说,溶剂的混合按体积比 (V/V)或重量比 (W/W)进行。溶液的体
积因温度而变化,所以按重量比混合可调制再现性较好的混合溶剂,
但由于操作较麻烦,通常多用体积比混合。只要没有特别标明,就可
按体积比进行混合,但在特殊情况下,如胺类粘度高的溶液混合时,
有时用重量—体积比 (W/V)的方法。
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的
目的,因此要求流动相具备以下的特点:
a、流动相对样品具有一定的溶解能力,保证样品组分不会沉淀在柱
中(或长时间保留在柱中)。流动相溶解度达不到要求时,尽量选用流
动相中含有的比例较大的成分,以减轻进样对流动相的影响造成基线
不稳。
b、流动相与样品不产生化学反应,选用流动相配置对色谱峰影响最
小。
c、流动相的黏度要尽量小,以便得到好的分离效果;降低柱压降,
延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器,
最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。流动相组成溶剂均达不到要求
时,选取的溶剂应保证在设定波长内无紫外吸收。
e、流动相沸点不要太低,否则容易产生气泡,导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后,一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微
量气体既有利于检测,还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
下面21项注意让你更懂液相流动相。
1、选择流动相应注意过滤溶剂
溶剂在使用前一定要用0.5μm的过滤器过滤,如果使用固体化学试
剂 (缓冲盐)配制流动相,过滤特别重要,不能让固体微粒污染泵,
阻塞进样器和柱头过滤片。本实验室有水溶性和脂溶性两种过滤膜供
选择 (反光面朝上),过滤水溶性流动相时 (如甲醇/水),先用1~2mL
甲醇润湿过滤膜,有助于快速抽滤。
2、注意保持储液瓶的清洁
用普通溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子,最后一次应用
HPLC级的水或溶剂清洗,不能在清洗过程中留下污迹。
3、注意保证溶剂的质量
一定要用HPLC级的溶剂,水也应达到HPLC级,同样也要使用高纯
度的缓冲盐。
4、注意流动相脱气不充分
流动相受热,或者流动相不同组分混合时会有气体产生,气泡进入泵
内引起压力波动,增加噪音,色谱图上出现毛刺。可试用下列方法解
决问题:流动相再脱气;采用更有效的脱气方法或两种方法配合使用;
改系统内混合为系统外预混合。HPLC所用流动相必须预先脱气,否
则容易在系统内逸出气泡,影响泵的工作。
系统中气泡的产生:流动相本身存在,梯度淋洗混合后放出气泡;气
泡的影响:存在于管路中,系统压力不稳定,实验结果有偏差;存在
于单向阀中,易造成液体回流,流量不准确,甚至是不吸液存在于检
测器中,出现鬼峰,影响检测准确性。所以做液相对流动相的气泡和
杂质要求比较严格。气泡会影响柱的分离效率,检测器的灵敏度、基
线稳定性,甚至使无法检测。(噪声增大,基线不稳,突然跳动)。此
外,溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相 (如烷基
胺)反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化,对分离或分析结果带
来误差。溶解氧能与某些溶剂 (如,甲醇、四氢呋喃)形成有紫外吸
收的络合物,此络合物会提高背景吸收 (特别是在260nm 以下),并
导致检测灵敏度的轻微降低,但更重要的是,会在梯度淋洗时造成基
线漂移或形成鬼峰 (假峰)。在荧光检测中,溶解氧在一定条件下还
会引起淬灭现象,特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下,
荧光响应可降低达95%。在电化学检测中 (特别是还原电化学法),
氧的影响更大。除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检测器的性能,
也将改善在一些荧光检测应用中的灵敏度。
常用的脱气方法有:加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。对混合溶剂,
若采用抽气或煮沸法,则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。
(1)氦气脱气:氦气脱气是很有效的脱气方法。氦气缓缓的通过流
动相赶去溶入的空气,如果使用得当,在 10min 内可除去80%~90%
的溶入气
文档评论(0)