细胞凋亡与增殖的原位检测.pptxVIP

细胞增殖与凋亡的原位检测技术第一页，共六十四页。一、细胞增殖活性原位检测技术 细胞增殖(cell proliferation) 是细胞数量的增加，其快慢即为增殖活性。 第二页，共六十四页。细胞周期图①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间； G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期，③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。G0期细胞：细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期第三页，共六十四页。依据细胞的分裂能力，机体的细胞分为三类：不稳定细胞(labile cells) ， 持续分裂细胞稳定细胞(stable cells) ， 静止细胞 处G0期永久细胞(permanent cells) ，不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞第四页，共六十四页。 根据细胞周期将细胞群分为两类 分裂细胞指进入G1期后进行分裂的细胞； 非分裂细胞是指处于G0期细胞及非增生的终末细胞。肿瘤细胞群也如此。第五页，共六十四页。 增殖分数或生长分数 分裂细胞与细胞总数之比值。 生长分数值越大，增殖活性越高。 测定生长分数能判断细胞群的增殖活性，即增殖快慢。 第六页，共六十四页。生理状态下： 不稳定细胞、稳定细胞呈现着活跃或较活跃的增生，补充因凋亡而丧失的细胞，保持机体、器官或组织细胞数量的动态平衡 。 第七页，共六十四页。病理状态下： 反应性增生 组织细胞损伤或炎症刺激等均可引起细胞增生 ； 肿瘤性增生 肿瘤的本质是细胞增生紊乱所致。即使去除刺激因素，瘤细胞仍可持续增生。 第八页，共六十四页。 原位研究细胞增生活性，不仅涉及生理性及反应性细胞增生，更多是研究肿瘤细胞的增生活性。第九页，共六十四页。（一）原位检测细胞增生活性的常用方法及注意事项 测定细胞增生活性的方法有： 核分裂像计数 Feulgen染色后显微分光光度法 免疫组织（或细胞）化学技术显示与细胞增生与分裂 相关的抗原 嗜银核仁组织区法(argyrophil-stained nucleolar organizer region AgNORs) 第十页，共六十四页。3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷掺入标记技术溴脱氧尿嘧啶核苷（胸腺嘧啶脱氧核苷相似物）标记技术流式细胞术测定S期细胞分数 第十一页，共六十四页。1. 核分裂像计数 核分裂像是人们可直接识别的细胞周期不同阶段的唯一细胞形态。因此，用光学显微镜就能进行计数。第十二页，共六十四页。第十三页，共六十四页。核分裂像计数有两种方法 高倍视野法（HPF） 一般在400倍放大下，随机选择一定数量（10个或更多）的HPF，分别观察并计数其中的核分裂像，最后算出平均每个HPF中的核分裂像数。 第十四页，共六十四页。核分裂指数（MI） 测量时，可在显微镜目镜内放置网格测微尺，随机选择一定数量的视野，计数不同区域一定数量的网格内核分裂像数，最后算出占所测细胞总数之比例，实质上，也是一种生长分数 。第十五页，共六十四页。注意事项： 严格控制切片厚度 在较厚的切片观察时，微调显微镜可在不同平面计数核分裂像，与较薄切片相比，显然增加了计数机会。 组织标本固定时间 若组织不及时固定，细胞仍有分裂机会，也会增加核分裂计数可能性。 切片不能过染 切片过染会导致核分裂像辨认困难。 用同一台或HPF面积相同的显微镜计数 第十六页，共六十四页。 2.免疫组织（或细胞）化学方法 通过染色细胞增生相关的核蛋白判断细胞的增生活性。 Ki67 因其所测的蛋白只表达在G1，G2，M和S期的细胞，G0 期及G1早期细胞不表达。 第十七页，共六十四页。 PCNA 是针对增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的抗体。在除G0期外的其它时相细胞均可测出。但水平不一，G1期迅速增加，G1/S交界期达高峰，S期维持高水平，G2期开始下降，G1早期和M期表达水平最低。 第十八页，共六十四页。MCM蛋白（微染色体维持蛋白） 是启动DNA复制和延伸的关键蛋白。只在具有增殖潜能和增殖细胞中表达。可显示整个细胞周期细胞。第十九页，共六十四页。DNA拓扑异构酶Ⅱa 是一种核酶，参与DNA复制、基因转录、染色体聚集及催化有丝分裂和减数分裂的染色体分离，在细胞增殖中其重要作用。第二十页，共六十四页。细胞周期中不同时期的关卡蛋白或调节元件 细胞周期素A、B、C、D、E 周期素依赖性激酶（CDK）第二十一页，共六十四页。 Ki67或PCNA抗原在核内表达．故增生细胞的核呈棕色或红色，用苏木素衬染也能清楚区分阳性与阴性细胞。第二十二页，