第章色谱分离技术.pptVIP

1. 载体的选择 常用的亲和色谱载体主要有多孔玻璃载体、聚丙稀酰胺载体、纤维素载体、葡聚糖凝胶载体、琼脂糖凝胶和交联琼脂糖凝胶载体等。 当前94页，总共135页。 2. 配基的选择 根据配基应用和性质，可将其分为两类：特殊配基和通用配基。亲和层析中常用的特殊配基有某一抗原的抗体、某一酶的专用抑制剂、某一激素的受体等。通用配基可适用于一类物质的分离提纯，如用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配基。 当前95页，总共135页。 6．膨胀性(膨胀度) 干树脂浸在水溶液或有机溶剂中时，活性离子因热运动可在树脂空隙的一定距离内运动，同时由于存在着渗透压使外部水分渗入内部促使树脂空隙扩大而体积膨胀。测定膨胀前后树脂的体积比，可得出膨胀度。在设计离子交换罐时，树脂的装填系数应以工艺过程中膨胀度最大时的树脂体积为上限参数，以免装量过度或设备利用率降低。 当前62页，总共135页。 二、离子交换树脂的性质和种类 三、离子交换树脂的选择依据 离子交换交换色谱常用较细的树脂(50~100 目)。但一般树脂的粒度较大，因此需要将树脂 粉碎、过筛后使用，过筛分干法和湿法两种。干 法较简单，但实际使用时粒度仍不均匀。利用水 力浮选法，将树脂分级比较方便。改变水的流速 就可得到不同粒度的树脂。 当前63页，总共135页。 三、离子交换树脂的选择依据 树脂的骨架结构。 目的分子的大小 介质上带电功能基团 功能基团的强弱 当前64页，总共135页。 四、流动相的选择依据 离子交换色谱的流动相必须是有一定离子强度的并且对pH有一定缓冲能力的溶液。使用缓冲液可稳定流动相的pH，使之在层析过程中不致发生明显变化，同时还可以稳定目的分子上的电荷量，保证层析结果的重现性。 要使目的分子带有电荷并以适当的强度结合到离子交换介质上，需要选择一合适的吸附pH。对于阴离子交换介质，吸附pH至少应高于目的分子等电点一个pH单位。 当前65页，总共135页。 四、流动相的选择依据 吸附阶段应选择允许目的分子与介质结构达到最高的离子强度。而洗脱时要选择可使目的分子与介质解吸的最低离子强度。这就定出了洗脱液离子强度的剃度起止范围。在介质再生之前往往还需用第三种离子强度更高的缓冲液流洗柱床以彻底消除可能残留的牢固吸附杂质。在大部分情况下，吸附阶段溶液盐浓度至少应在10mmol/L以上。 当前66页，总共135页。 五、操作方法 1. 离子交换剂的处理 2. 装柱及上样 装柱主要是防止出现气泡和分层，装填要均匀。防止产生气泡和分层的方法是装柱时柱内先保持一定高度的起始洗脱液(一般为柱高的1/3)，加入树脂时使树脂借水的浮力慢慢自然沉降。装柱完毕后，用水或缓冲液平衡到所需的条件，如特定的pH、离子强度等。 当前67页，总共135页。 上样 加压法是采用打气入柱的方式进行加压，可用一个装有样品的分液漏斗与柱用橡皮塞连接，分液漏斗上端串有压力剂并经缓冲瓶与打气管相连，当达到所需压力时就将打气管夹紧。减压法是在柱的排出口增设抽气装置，工业上多采用此法。 当前68页，总共135页。 3.洗脱 分离不同的物质选用不同的洗脱剂。原则是用一种更活泼的离子把交换在树脂上的物质再交换出来。常用的洗脱剂为酸类、碱类或盐类溶液，改变整个系统的酸碱度和离子强度，以使交换物质的交换性能发生变化，己交换上的物质就逐渐被洗脱下来。为了提高分辨率，常采用剃度洗脱法。 当前69页，总共135页。 4 凝胶色谱法 凝胶色谱是基于分子大小不同而进行分离的一种分离技术，又称之凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析或排阻层析。它具有一系列的优点：操作方便、不会使物质变性、适用于不稳定的化合物、凝胶不用再生、可反复使用。缺点：分离速度较慢。 当前70页，总共135页。 一、基本原理 小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。 当前71页，总共135页。 当前72页，总共135页。 凝胶过滤层析过程示意图 小分子 大分子 凝胶基质 凝胶珠 当前73页，总共135页。 二、凝胶过滤介质 理想的凝胶过滤介质具有高物理强度及化学稳定性，能够耐受高温高压和强酸强碱，具有高化学惰性，内孔径分布范围窄，珠粒颗粒大小均一度高。目前，常用的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。 当前74页，总共135页。 1. 葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶是应用最广泛的一类凝胶，国外商品名为Sephadex。它由葡聚糖Dextran交联而得。交联剂在原料总质量中所占的百分数叫交联度。交联度越大，