《氨基酸工艺学》8 氨基酸生产指标检测(文字版).pptVIP

* 4 14 86 10 30 70 20 70 30 25 90 10 26 100 0 (5) 测定方法： ① 氨基酸衍生化：根据发酵液周期确定发酵液的稀释倍数。取稀释样液 10 μL 于 1.5 mL 的离心管中，依次加入 200 μLNaHCO3 溶液，100 μL1%DNFB 溶液，混匀后置于 60℃水浴中避光衍生 60 min，冷却至室温，加入 800 μLKH2PO4 缓冲溶液，混匀后用 0.22 μm 针筒过滤器过滤，取 20 μL 进行色谱分析。 ② 标准曲线的绘制：在离心管中分别加入 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 标准氨基酸溶液，加超纯水定容至 1.0 mL，然后进 行衍生反应。根据高效液相色谱仪检测结果，以溶液浓度为横坐标，标准液峰面积为纵坐标，进行标准曲线的绘制。 表 8-14 流动相梯度洗脱程序 时间 流动相 B 流动相 D 0 14 86 2 12 88 * 氨(NH4+)含量分析 原理：NH +在沸腾的碱性溶液中可呈现 NH3，而逸出的氨可以被硼酸吸收，其硼酸按可用盐酸滴定。反应如下： 4 NH4 +OH ? NH3 ? +H2O + - NH3 ? H3BO3 ? NH4 ? H BO + - 2 3 NH4 ? H2BO3 ? HCl ? H3BO3 +NH4Cl + - 试剂和仪器： ① 氢氧化钠溶液：用蒸馏水配制成 30%溶液。 ② 硼酸溶液：用蒸馏水配制成 4%溶液。 ③ 0.1mol/L 盐酸标准溶液。 ④ 甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：精确称量 0.1 g 甲基红加 100 mL 酒精溶液，精确称量 0.1 g 溴甲酚绿加 100 mL 酒精溶液，取 4 mL0.1%甲基红酒精溶液与 10 mL 0.1%溴甲酚绿酒精溶液混合即成。 测定方法：精确吸取样品 5 mL，置于 500 mL 平底烧瓶中，盖好装有液下管和氮气球的胶塞，使氮气球另一端与冷凝器相连 接，使冷凝器另一端伸入放有 10 mL 硼酸溶液的 250 mL 三角瓶的液下。装好后，自平底烧瓶的液下管加入 5 mL30%氢氧化钠溶液， 要小心摇匀。然后自平底烧瓶的液下管通入蒸汽开始蒸馏，直到三角瓶中馏出液达 150 mL 左右停止。用少量的蒸馏水冲洗冷凝器，洗 液并入三角瓶中。取下三角瓶加甲基红-溴甲酚绿混合指示剂 10 滴，以 0.1 mol/L 盐酸标准溶液滴至显红色为止。同时做空白试验。 结果计算：按下列公式计算。 x= (V1 -V0 )×0.018×c ×100 5 式中： X——被测样品的含 NH4+量，g/mL； V0——空白滴定消耗的盐酸标准溶液体积，mL； V1——试样滴定消耗的盐酸标准溶液体积，mL； C—— 盐 酸 标 准 溶 液 的 浓 度 ，mol/L； 0.018——NH4+的毫摩尔质量。 光密度(OD)测定 原理：根据比尔定律，一定波长的光透过能相应地吸收这种光的溶液时，其光密度大小与发酵液的菌体数量成正比。测定发 酵液的光密度，能相应表达氨基酸生产菌的生长繁殖程度。 (2) 测定方法： ① 发酵液直接测定法：取摇匀的发酵液放入厚度为 1 cm 的比色杯中，用 581-G 型光电比色计，在波长 660 nm 下，以蒸馏水作对照，测出光密度(OD)。 ② 发酵液稀释法：取摇匀后的样品 1 mL，用水稀释至 25 mL，用 72 型分光光度计，在 660 nm 波长下，光程 2 cm，蒸馏水为空 白，测出光密度(OD)。 糖蜜发酵液一般用稀释法(稀释 25 倍)测定光密度，光程为 1 cm，波长为 660 nm，使用 72 型分光光度计。 * * * 氨基酸总量分析(比色法) 原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进 行测定。 试剂和仪器： ① CuCl2·2H2O：2.8 g，用蒸馏水定容至 100 mL。 ② NaPO4·10H2O：13.7 g，用蒸馏水定容至 200 mL。 ③ NaB4O7·10H2O：76.4 g，用蒸馏水定容至 4000 mL。 将①②混合产生沉淀，用滤纸过滤，沉淀用③洗三次。将沉淀取下，加入 300 mL③，混匀，过滤除去上清液。沉淀加入 30 g NaCI，再加入③定容至 500 mL 为磷酸酮试剂。 测定方法： 取发酵液样品 1 mL 稀释至 50 mL。取上述稀释液 10 mL，加磷酸酮试剂 10 mL 摇匀，停 5 min，用滤纸过滤，滤液为蓝色。将滤 液倒入Φ20 mm H 形比色管中，放比色计上，测定比色波长 610 nm 的 OD 值。采用上述方法，测定标准天冬氨酸在不同浓度下的 OD 值，绘制标准曲线。根据标准曲线，计