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体内药物分析实验
HPLC 法测定大鼠血浆中的山奈酚1.1目的要求1.掌握血
浆样品的前处理方法。
熟悉方法回收率和萃取回收率实验操作和评价。
熟悉大鼠眼眶采血技术； 熟悉方法学研究中其他评价内容。
1.2 主要实验材料与仪器 山奈酚(Kaempferol)及其对照品，
黄芩素(baicalein )，抗坏血酸， 肝素，-葡萄糖醛酸苷酶
(-glucuronidase )和硫酸酯酶 (sulfatase )，分析纯甲醇， 冰醋 酸、无水乙醚， 色谱纯乙腈； 高效液相色谱仪， 氮吹装置， 恒 温水浴，漩涡混合器，13000r/mi n台式离心机， 不同规格移液枪
(5, 20, 50, 100, 200, 1000L ) 和容量瓶(10，25mL), 5~10mL
具塞离心管若干； 雄性SD大鼠(180~220g)。
1.3 实验原理 山奈酚吸收进入体
内后，多以二相代谢物葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的形式存在。
由于山奈酚葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的对照品难以获得， 故米用加
入硫酸酯和葡醛酸苷水解酶处理样品， 使代谢物水解后测定苷元山
奈酚的浓度。
实验以黄芩素为内标，HPLC法测定血浆中山奈酚浓度， 对建
立的方法进行方法学评价。
1.4 实验方法1.色谱条件：
C18 柱(250mm4.6m,5m),配保护柱，柱温 40C；乙腈-0.5% 冰醋酸（35:65 ）为流动相，流速1mL/min ;检测波长370nm;进 样量20L。
溶液配制：
取山奈酚对照品约2.5mg，精密称定， 置25mL量瓶中，用 甲醇溶解并定容。
精密吸取适量， 分别用甲醇稀释成0.3、0.6、3、6、9、20 和30g/mL的标准系列溶液， 置4C冰箱保存。
另取黄芩素适量， 精密称定， 用甲醇溶解并定量稀释至
0.1mg/mL的溶液，精密吸取1.5mL置10mL量瓶中，用甲醇定容， 得内标溶液， 置4 C冰箱保存。
血浆样品处理：
取大鼠血浆样品120L ,加入甲醇20L、1%冰醋酸（含2mg/mL 抗坏血酸）32L、-葡萄糖醛酸苷酶（20U/mL）和硫酸酯酶（6U/mL） 的混合水溶液50L , 37C水浴温育30min后，加入内标溶液50L , 然后加无水乙醚2mL,漩涡混合5min ,于12019r/min离心5min ; 取上清液在氮气流下挥干， 残留物用100L甲醇复溶，12019r/min
离心5min ,取上清液进样分析。
专属性考察：
取空白血浆、添加山奈酚与内标的空白血浆、 血浆样品，按
血浆样处理项下方法处理，照色谱条件项下方法进样测定。
比较所得色谱图， 考察血浆内源性物质是否干扰测定， 药物及
内标是否达到基线分离。
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若有必要， 适当调整色谱条件， 已达到专属性要求。
标准曲线制备：
精密吸取120L大鼠空白血浆9份，分别加入20L不同浓度
的标准系列溶液，制得0.0 （空白）、0.0 （空白+内标）、0.05、0.1、
0.5、1.5、3和5g/mL的山奈酚血浆标准溶液（每个浓度点平 …
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