免疫分析法课件.ppt

* * 【练习与思考】 1、简述免疫分析法的基本原理及应满足的基本条件？ 2、简述抗原－抗体反应的特点及方法的分类？ 3、简述均相免疫分析和非均相免疫分析？ 4、简述F与B的分离方法？ 5、简述酶免疫分析中常用到的标记酶及相关的酶底物？ 6、简述酶联免疫吸附测定的基本原理与操作？ 免疫分析法ppt课件全文共95页，当前为第95页。 * * 四、标准曲线的制备与样品测定步骤 免疫分析法ppt课件全文共95页，当前为第63页。 * * (一)标准曲线的绘制 取标准抗原，用无放射活性的空白血清或血浆稀释成5－8个系列浓度。 加入定量标记抗原，其总放射性(T)应能满足准确测量的需要。 加入定量的已稀释好的特异抗体，其抗体的量应满足灵敏度的要求。 将标准抗原、标记抗原、特异抗体与缓冲液混匀后，在适当条件下温育，待反应平衡后测定总计数率(T)。 免疫分析法ppt课件全文共95页，当前为第64页。 * * 加入分离剂，使结合部分(B)与游离部分(F)分离。 测定各管结合部分或游离部分的计数率。 标准曲线通常以标准抗原(待测药物标准品)的浓度为横坐标，以结合率(B％)为纵坐标作图。 纵坐标B％的计算有两种方法：一种是将与抗体结合的标记药物的放射性强度(B)与加入的标记药物总放射性强度(T)比较，即B％=(B／T)×100％；另一种是用零标准管(不加药物标准品)的放射性强度B0代替T比较，即B％=(B／B0)×100％。 免疫分析法ppt课件全文共95页，当前为第65页。 * * (二)样品测定步骤 下述情况样品需进行简单处理： 测定方法不够灵敏，可将被测物适当浓集； 测定方法不很专属，可将被测物与其它干扰物质分离； 待测物以缀合物形式存在，可设法使其游离，然后进行测定。 免疫分析法ppt课件全文共95页，当前为第66页。 * * 例：125I－RIA(DCC沉淀法)测定血清中地高辛浓度 待测血清样品50μl→样品管中;含不同浓度地高辛标准品的血清50μl→标准曲线各管中;50μl 空白人血清→零标准管.各管中依次加入保温液100μl→抗体溶液100μl→125I标记的地高辛(溶液)100μl摇匀→在室温(15～25℃)放置30min→γ-计数器测定各管的总计数T(即加人的协I总放射性剂量)→在电磁搅拌(或手摇)下，迅速向各管内加人1ml工作液(全部加完控制在5min内)，摇匀→离心10min(3000r/min)→倾去上清液→γ-计数器测定各管中沉淀的计数F(游离协I地高辛放射性强度)→计算出标准曲线各管和样品各管的结合率。 免疫分析法ppt课件全文共95页，当前为第67页。 * * 免疫分析法ppt课件全文共95页，当前为第68页。 * * 五、方法评价 灵敏度高、特异性强、取样量少、适用于大批量样品的测定。 需用放射性同位素标记抗原，其放射性对操作人员的健康、对环境的污染都会造成危害，而且还需有专用的同位素实验室及免疫测定仪器，成本较高，因而使其普及受到限制。 免疫分析法ppt课件全文共95页，当前为第69页。 * * 六、应用例如 固相放射免疫分析试剂盒测定血清中地高辛 浓度的方法 1．主要试剂 2．测定方法 免疫分析法ppt课件全文共95页，当前为第70页。 * * 3．结果计算 (1)标准曲线法 以地高辛标准品血清浓度为横坐标，B标／T(％)为纵坐标，在半对数坐标纸上绘出标准曲线。。 以地高辛标准品血清浓度为横坐标，但用(B标-BNSB)/(B0－BNSB)(％)为纵坐标作标准曲线，当测得血清样品的(B样－BNSB)/(B0-BNSB)(％)值后，也可从标准曲线上得到对应的血清药浓 免疫分析法ppt课件全文共95页，当前为第71页。 * * (2)回归方程计算法 以logx为自变量(x为血清中地高辛标准品的浓度)，以logitY为因变量进行直线回归 免疫分析法ppt课件全文共95页，当前为第72页。 * * 第三节 酶免疫分析法 酶标记抗原 均相酶免疫分析 非均相酶免疫分析 方法评价 应用示例 免疫分析法ppt课件全文共95页，当前为第73页。 * * 酶免疫分析(Enzyme Immunoassay，EIA)是以酶作为标记物的免疫测定方法。酶免疫分析法是1971年由Engvall等人在RIA的基础上发展产生起来的一种新的免疫分析方法。 免疫分析法ppt课件全文共95页，当前为第74页。 * * 一、酶标记抗原 (一)标记酶的选择 特异性强，酶蛋白分子中应具有足够的活性基团，以便能与药物结合。 活性要高，即当底物浓度低时，确有较高的催化反应率。 酶的活性不易受样品中其它成分影响，有较好的稳定性。 酶的纯度要高，且生物体液中应无标记酶、底物、抑制剂及其它干扰物质存在。 酶的活性测量方法应简单、灵敏、精密和快