实验室设备安全第四章电泳技术.pptx

第四章 电泳技术第一节前言首次应用于生物学一、电泳 历 史首次称为电泳++--1809年，俄国物理学家Re?ss进行了世界上第一次电泳实验。显示了电渗透现象，为电泳理论和技术的发展奠定了基础。电泳前电泳后：阳极粘土颗粒上移，浑浊 阴极清澈，水面上升Tiselius和移动界面电泳 获诺贝尔奖，证明了血清是由白蛋白、 α、β、γ球蛋白组成的。移动界面电泳使解决生理学和医学问题达到了一个新水平！Tiselius 电泳槽（C）和电极（V1和V2）电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。例如蛋白质具有两性电离性质，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，反之则带正电荷，向负极移动。当蛋白质溶液pH值与蛋白质的等电点相等，静电荷为零时则不移动。二、电泳的分类（一）按分离的原理区分：电泳按分离的原理可分为4种，即区带电泳(zone EP，ZEP)、移界电泳(moving boundary EP，MBEP)、等速电泳(isotachophoresis，ITP)等电聚焦(isoelectric cusing，IEF)。 1、区带电泳 不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，如果用光密度计扫描可得出—个个互相分离的峰2、移界电泳 它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得出一个个台阶状的图形。3、等速电泳 在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按浓度对距离作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。4、等电聚焦 由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成pH梯度。被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率很高。（二）按有无固体支持物区分根据电泳是在溶液中进行还是在固体支持物上进行，又可以分为自由电泳和支持物电泳两大类。自由电泳又可分为：①显微镜电泳(也称细胞电泳) ；②移界电泳；③柱电泳；④自由流动幕电泳；⑤等速电泳； 按有无固体支持物区分又可以分为: 自由电泳和支持物电泳两大类五十年代后，才开始固体介质电泳凝胶电泳使电泳技术得到了更快的发展总之，各种电泳技术具有以下特点：①凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可进行定性或定量分析；②样品用量极少；③设备简单；④可在常温进行；⑤操作简便省时；⑥分辨率高。第二节 常用的电泳技术一、Tiselius移界电泳法Tiselius的移界电泳法具有重要的历史意义，它的成功在于巧妙地解决了几个问题：①能够形成清晰的起始界面；②靠密度梯度能够稳定界面；③能良好的散热；④在泳动过程中可用光学方法显示其组分。二、区带电泳1、滤纸及醋酸纤维素薄膜电泳它具有简单快速等优点：①电泳区带界限清晰；②通电时间较短(20min至1 h)；③对各种蛋白质基本无吸附，因此无拖尾现象；④不吸附染料，显示电泳区带背景干净。 2、高压电泳高压电泳适用于分离低分子物质，如氨基酸、肽、抗生素及其他有机和无机物。因为低分子物质易扩散，高电压可使其移动快，在短时间内达到分离，减少扩散的影响。3、连续电泳用一张垂直悬挂的滤纸作支持物，由上方连续加样，缓冲液连续由上方流下来，电极加在左右两方，电场方向与液流方向垂直。分离的成分由下方分别以试管收集4、凝胶电泳（1）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是由D—半乳糖和3、6—脱水—L—半乳糖结合的链状多糖 相关知识：① 影响琼脂糖凝胶DNA迁移速率的因素迁移速率由DNA的分子大小琼脂糖浓度DNA的构象所加电压电场方向碱基组成与温度嵌入染料的存在电泳缓冲液的组成等许多参数确定。琼脂糖凝胶电泳装置实验步骤EB90℃以上熔化，凝胶温度35-43 ℃制 胶1231、孔深2、预留尺寸3、梳子宽度1+2= 胶的厚度3-+加缓冲液拔梳子最好在电泳槽中-+点 样-+紫外电 泳﹣﹣﹢﹢DNA空间结构电压 EB电泳结果分析脉冲电场（PFGE） 解决大分子DNA电泳问题 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)早在1959年由Raymends和 Weintraub．L建立。1964年，此法进一步从理论和实验技术上得到改进并推广应用。由于具有较高的分辨率和灵活性，目前已被广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离和分析。 几个原理及名词：凝胶原理SDS作用与变性、非变性连续与不连续1xSDS : 50 mmol/L Tris-Hcl(PH6.8)100 mmol/L DTT2% SDS 0.1% 溴酚蓝10% 甘油样品缓冲液缓冲液凝胶缓冲液Tris 碱 用盐酸一次调PH成功0.1% SDS1xTris – 甘氨酸 :25 mmol/L