教学课件 马铃薯病毒及其检测技术--苑智华.ppt

（四）免疫捕捉-RT-PCR检测技术 免疫捕捉-RT-PCR（Immunocapture-RT-PCR，IC-RT-PCR） 1．基本原理 2．操作方法 （１）病毒粒体的免疫捕捉 （２）RT-PCR扩增 （五）荧光竞争-RT-PCR检测技术 利用荧光竞争-RT-PCR（Competitve Fluorescent-RT-PCR，CF-RT-PCR）对PVYN和PVYO进行了检测。 上述各种马铃薯病毒RT-PCR检测技术均具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，仅用微量感病组织汁液即可检测到病毒的存在。此类技术不仅可以在基因水平上为植物病毒的检测提供更灵敏的手段，而且可与核酸序列分析结合，检测基因序列的变异，分析不同病毒分离物、不同病毒株系间的序列差异，比较亲缘关系，为病毒的鉴定提供可靠依据。 （六）荧光定量PCR 1．荧光定量PCR技术的基本原理和特点 荧光定量PCR技术（Real-time PCR技术）是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过对荧光信号累积的实时监测来监控整个PCR反应进程。 2．Ct值 如果检测到的荧光信号超过阈值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的阈值循环数（Ct）。Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3．实时荧光定量PCR技术的各种荧光定量方法 目前real-time PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是DNA结合染色、水解探针、分子信标、荧光标记引物、杂交探针，它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。 对扩增序列具有特异性的检测方法是在PCR反应中利用标记有荧光染料的特异性寡核苷酸探针来检测产物。 主要有以下几种： （１）TaqMan探针（见下图） 图4-5 TaqMan荧光探针工作原理 2．决定抗原免疫原性的条件 某种物质是否能够刺激机体产生免疫应答，取决于该物质本身的性质和该物质与机体相互的作用。影响这种相互作用的因素有以下两种： （1）抗原自身的因素 （2）生物学因素 3．抗原抗体反应的特点 （1）特异性 （2）比例性。 （3）可逆性。 （二）血清学检测技术的原理 在实际工作中，应用最多的有两种方法： 一种叫酶联免疫法（ELISA），此法则通过酶反应将抗原抗体反应信号放大，从而提高了检测灵敏度，而且还能通过产生有颜色的底物用仪器或肉眼识别，此法一般在酶联板上或膜上进行，进行一次检测需要4小时左右。 另一种叫做试纸条法，此法主要将特异的抗体交联到试纸条上或有颜色的物质上，当纸上抗体和特异性抗原结合后，再和带有颜色的特异抗体进行反应时，就形成了带有颜色的三明治结构，如果没有抗原则没有颜色。 血清学检测快速，且具有一定的灵敏度，也能进行半定量，尤其是试纸条法，不需要特殊的仪器设备，在现场检验或初筛中具有较好的应有前景。但血清学方法具有三个方面的局限性：第一，由于抗原抗体反应的专一性，每种被检测对象都需要开发和建立专门的检测试剂盒方法；第二，由于血清学的检测对象是蛋白质，对于加工过的检测对象中的蛋白质抗原性很容易破坏，从而影响检测结果的准确性；第三，有些检测对象如转基因产品外来插入基因基本就不表达出蛋白质，或者表达量很低，或者表达量变化很大，从而无法用此法进行检测。 二、马铃薯病毒抗血清的制备 （一）抗原的获得 目前应用于马铃薯病毒抗血清制备的抗原主要有提纯的病毒粒体、病毒外壳蛋白基因体外表达产物、连接于动物表达载体上的病毒DNA三种形式。 （二）抗血清的制备方法及步骤 1．动物的选择 常用的免疫动物主要有羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量来进行。 2．免疫剂量、时间和途径 免疫原合适剂量的选定应考虑抗原性强弱、分子量大小和免疫时间。 3．佐剂 佐剂是非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。 4．免疫方法 抗原剂量的确定 5．抗血清的采集与保存 （１）采血方式 （２）耳缘静脉或耳动脉放血的操作步骤 （３）颈动脉放血 （４）血清的析出与保存 6．抗血清质量的评价 不同的动物或同一种动物在不同的时间内抗血清的效价、特异性、亲合力等都可能发生变化。必须经常采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。 （１）抗血清效价的评价 ①放射免疫法；②双向扩散法 （２）特异性的测定 （３）亲合力的测定 7．抗血清制备失败的原因及措施 如果进行免疫后所得抗血清未通过上述评价，即可认为抗血清制备失败。 一般抗血清制备失败的原凶主要有以下几个： （１）动物的种属及品系不合适 （２）抗原质量不好 （３）制备的免疫原不符合要求 （４）佐剂的乳