GFP的简介和应用.pdf

GFP 的简介和应用 GFP的简介和应用 【摘要】源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白 （GFP），是一种极具应用潜 力的标记物，有着极其广泛的应用前景。本文就GFP的理化性质、荧光特性、改进以及它 在科学研究中发挥的作用进行了综述。 【关键词】绿色荧光蛋白（GFP）、标记物、荧光特性、进展、改进、应用、干细胞移植 【正文】 一、GFP的简介 1.GFP的理化性质，荧光特性及其改进 1.1GFP的理化性质 从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨 3 基酸。GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。AequoriaGFP分子量约27×10 ， 一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽；而RenillaGFP是分子量为54kD 的同 型二聚体。两种GFP有不同的激发光谱，AequoriaGFP在395nm具有最高光吸收峰，肩峰 为473nm；RenillaGFP在498nm具有强烈的光吸收，肩峰为470nm。两种GFP含有相同的 生色团，发射光谱基本相同（λmax=508~509nm）。 GFP性质极其稳定，易耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。其变性 需在90℃或pH4.0或pH12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境，或去除 变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变 化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是，它们在很大的pH范围内的吸 收、发射光谱也是相同的。RenillaGFP的稳定性就更为显著。它在上述一系列的变性条件 下都很稳定，不易变性。根据Sheen等的研究，GFP在受体内表达时，其稳定性并不亚于 CAT蛋白，因而可以得到持续时间较长的荧光。 1.2GFP的荧光原理 GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。GFP表达后折叠， 在氧存在的条件下，使66位氨基酸残基的α、β键间脱氢。由65~67位的氨基酸残基 （Ser-Tyr–Gly ）环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮 （4-p-hydroxybene-5-imidazolinone ）， 形成生色团 （基于组成生色团的元件不同，可将已知的GFP及其变种分为7种，每一种都有 一组不同的荧光激发和发射波长)。GFP无需再加任何底物和辅助因子，在紫外或蓝光激发 下就能发荧光，在450~490nm蓝光激发下，GFP荧光至少能保持10min以上，不像其他荧 1 GFP 的简介和应用 光素， 荧光容易淬灭。其中，GFP的一个引人注目的特点，其生色团的形成没有物种的特异性。 可以在翻译后2~4h通过自动催化作用来合成。Cubitt等认为生色团自身环化的驱动力来自蛋 白质三维结构的形成，由此Kolb等提出一个假说，即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行。 1.3GFP的荧光性质及应用优点 GFP的荧光性质比较特殊，具有诸多优点而备受关注。 （1）易于检测，灵敏度高。 GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光， 用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到。其次，即便是未经纯化的GFP发射的绿光也是相当 强的，在正常室内光线下仍清晰可辨。对于单细胞水平的表达也可识别。 （2 ）荧光性质稳定。 GFP对光漂白 （一种荧光衰减现象）有较强的耐受性，能耐受长时间的光照，从而延长了 可探测时间；GFP在pH7~12范围内也能正常发光，对高温 （70℃）、碱性、除垢剂、盐、 有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。 （3 ）对细胞无毒害。 从目前的研究结果来看，GFP对生活的细胞基本无毒害，与目的基因融合后，对目的基因 的结构功能没有影响，转化后细胞仍可连续传代。 （4 ）构建载体方便。 由于编码GFP的基因序列很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使 质粒过大影响转化频率。 （5 ）可直接用于活细胞测定。 GFP是能在异源细胞内表达后，能自发产生荧光的蛋白，并且GFP的分子量较小，N-端和 C-端都能忍受蛋白的融合，是理想的标记物，可进行活细胞实