毛细管凝胶及无胶筛分电泳分离检测宽分子量范围DNA片段的研究.pdf

摘 要 摘 要 人类基因组计划的迅速发展促进了核酸分析技术在突变检测、分子诊断和疾病预防 以及治疗评估中的应用，寻找快速、易定量、自动化和高通量的核酸检测分析方法至关 Capillary electrophoresis CE 重要。毛细管电泳 （ ， ）具有分离效率高、操作模式多、试 样消耗少等优点，已成为蛋白质和核酸等生物大分子分离分析中不可或缺的工具。毛细 Capillary gel electrophoresis CGE Non-gel capillary 管凝胶电泳（ ， ）和毛细管无胶筛分电泳（ electrophoresis NGCE ， ）是两种常用的操作模式。 CGE 可有效分离分子量范围为50~ 2000bp 的较小DNA 片段，具有较高分辨率。 但是其凝胶黏度较大，制备和运行过程中容易产生气泡，使体系的稳定性和重现性变差， 对于较宽分子量范围的DNA 片段分辨率较低。NGCE 以低粘度的线性高分子溶液为筛 分介质，溶液中高分子之间相互交缠形成网孔，可起到筛分作用。这些低粘度的高分子 溶液可提供更快速，更稳定的分离，允许更大的灵活性和压力注射，也更容易实现自动 化。NGCE 可以提供更大孔隙的筛分介质，有利于分离较宽分子量范围的DNA 片段， DNA CGE NGCE 提高 测序对大分子片断的认读长度。本论文分别用 和 分离分析宽分 子量范围DNA 片段，并建立方法学，发现方法存在的问题，用新方法制作涂层毛细管 柱解决分离过程中重现性差，柱寿命短等问题。 本论文主要内容如下： CGE NGCE 第一章：综述了核酸分离分析的意义和常用的技术手段，介绍了 和 的 基本概念及其在核酸分离分析中的应用。 Linearpolyacrylamide LPA 第二章：以文献方法制作的线性聚丙烯酰胺 （ ， ）涂层毛 LPA CGE 100~ 2000 细管柱为分离通道， 为凝胶，采用 分离模式，优化分离条件建立了 bp 分子量范围DNA 片段的分离方法。在优化的CGE 分离条件下，选择QDL2,000DNA Marker 100bp 250bp 500bp 750bp 1000bp 2000bp DNA （包含 、 、 、 、 、 六个 片段）为 测试样品，建立了DNA 片段分子量和迁移时间的函数关系；对该CGE 分离方法进行 了方法学验证，并用于PCR 扩增产物中DNA 片段的定性和定量分析。结果表明，该方 法虽然制备凝胶柱时不易产生气泡，但是CGE 凝胶柱使用寿命较短，需要多次更换凝 胶。这可能是由于CGE 的凝胶不稳定造成的。 I 河北大学硕士学位论文 第三章：以文献方法制作的LPA 涂层毛细管柱为分离通道，LPA 为筛分介质，采 用NGCE 分离模式，建立了250~ 10000bp 分子量范围DNA 片段的分离方法。在优化 DL 10,000DNAMarker 250bp 500bp 10