DNA甲基化及其检测PPT演示幻灯片.ppt

应用五：甲基化敏感性单链构象分析（methylation specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）  甲基化敏感性单链构象分析 甲基化敏感性单链构象分析 优点： ①能够方便的应用于任何序列的甲基化状态分析； ②能够对甲基化的等位基因进行半定量； ③可以提示甲基化状态分布的不均匀性。 缺点： ①只有甲基化水平较高的单链才能明显的区分开，而较低水平的则不易分开，有时会因甲基化的CpG位点随机和不均匀分布导致电泳条带出现拥挤、拖尾的现象，故敏感性及准确性略低； ②检测片段不宜过长。 应用六：基于亲和纯化的甲基化分析方法 基于亲和纯化的甲基化分析方法 应用七：ChIP-Seq技术 ChIP-Seq 应用八：芯片技术在甲基化检测中的应用 启动子区甲基化芯片技术 基因芯片杂交信号图 应用九：HRM高分辨熔解曲线分析 HRM技术： 用于筛选大量样本，获得感兴趣的CpG位点 鉴定感兴趣的CpG 岛 。 HRM技术原理 HRM技术原理 HRM特点 高灵敏性：可检测低达0.1%甲基化程度。 高通量：1次可同时检测不超过384样本，适用于大样本多位点甲基化扫描。 高重复性：重复性100%。 使用范围广：不受碱基位点局限。 操作简便：只需设计特异引物，无须序列特异性探针，无需测序。 ??标本范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。 应用十：焦磷酸测序法 CpG岛(CpG islands) 在结构基因5’端附近的调控区段， CG二联核苷常常以成簇串联的形式排列，含量大于50%。 预测软件 http://pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.html http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/ 广泛性 可遗传性 DNA的甲基化如何调节基因表达？ A: 未甲基化或低度甲基化的启动子能够允许转录正常进行。 B: 甲基化的CpGs阻止转录因子的结合，因此阻止转录。 C: MBP ( Me-CpG binding protein ) 也阻止转录因子和启动子区的结合。 其他，如改变染色质结构，… 启动子高甲基化使基因表达受抑制 DNA 修复 基因表达的调节 癌基因代谢 凋亡 分化 细胞周期 DNA 甲基化 DNA甲基化的功能 三、DNA甲基化检测手段 DNA甲基化检测方法总览 主要检测途径 3-1 基于重亚硫酸盐转化的方法 3-2 不基于重亚硫酸盐转化的方法 3-1基于重亚硫酸盐转化的方法 质谱分析 水解核苷酸 质谱分析 基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理1 基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理2 应用一: 直接测序法（Direct sequencing) 直接测序法 图6 PMVK基因扩增产物反向测序结果 图7 TRIB3基因扩增产物正向测序结果 应用二： 重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序(Bisulfite-sequence PCR，BSP) 注： A：癌组织；B：癌旁组织；○-：未甲基化；●：甲基化 43A 43B M 43AE 43A 43BE 43B (369bp) 43B BSP克隆测序结果 BSP克隆测序甲基化率三维图形 应用三： 甲基化特异性PCR (methylafion-specific PCR，MS-PCR) 甲基化特异性PCR U M U M U M ladder 100 150 200 250 MSP法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化 图 MSP检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片 甲基化特异性PCR（MSP）结果，U为非甲基化，M为甲基化。 基因诊断中心郑芳实验室 MSP扩增产物凝胶电泳图 研究结果 注：M表示 甲基化，U表示未甲基化 B1-B6为高脂血症组六例标本，D1-D5为正常对照组五例标本； H2O为阴性对照；m为50bpMarker。 SREBP-1基因启动子区CpG岛甲基化状态 基因诊断中心郑芳实验室 甲基化特异性PCR 优点： ①操作简便； ②敏感性高。 缺点： ①引物设计要求高； ②只能作定性研究； ③存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性； ④只能了解部分位点的甲基化状态。 应用四：结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analys