完整版双向电泳原理与流程.ppt

31 / GE Title or job number / 2/16/2020 pH 3-10 L and NL from Prof. Angelika G? rg, Technical University Munich Tissue Proteins from Mouse Liver linear (L) nonlinear (NL) 32 / GE Title or job number / 2/16/2020 The IPGphor ? Platform 33 / GE Title or job number / 2/16/2020 IPG 胶条 水化 34 / GE Title or job number / 2/16/2020 IPG strip rehydration 如果水化时加入样品， 此体积是加入样品后的终体积 35 / GE Title or job number / 2/16/2020 加样品到胶条槽 36 / GE Title or job number / 2/16/2020 泡涨盘 VS 聚焦盘 37 / GE Title or job number / 2/16/2020 干胶条的水化 ? 主动水化：胶条槽内进行，大分子蛋白更容易进入胶 条； 30 － 120V ， 10 － 24Hrs ? 被动水化：专用水化盒中进行 NEW ！ – 无需覆盖油！ – 避免灰尘污染，空气作用 – 不透明盖子，适用于 CyDye DIGE 标记 – 同时适用于市场上所有 7 － 24cm 干胶条的水化 38 / GE Title or job number / 2/16/2020 ? 在样品杯中加入少量不含样品的水 化液检查是否漏液。上样前吸走水化 液。 ? 上样前将样品离心去掉不溶物，每 个样品杯最多可加样 150 μl 。 ? 盖上胶条槽的盖子，再盖 IPGphor 仪器的盖子。 ? 分别将两个 IEF 电极片放在 IPG 胶条 胶的两端，分别将电极压在两个电极片 的外缘。 ? 样品杯可放在两个电极间除胶条槽内 侧凸起外任何位置，对于碱性分离范围 的 IPG 胶条，尽量将样品杯靠近阳极放 置 . 杯上样 & 纸桥上样 39 / GE Title or job number / 2/16/2020 IEF 电泳 ? IPGphor 包括半导体温控系统 (20 ° C) 和程序化电源 (10000V) ? 可同时进行 12 根胶条的等电聚焦 ? 聚焦效果以“ Vh” 数控制，可提高 重复性 40 / GE Title or job number / 2/16/2020 IPG 胶条的平衡 —— 两步平衡 ? SDS 电泳前 , 平衡母液 : 2% SDS, 50mM Tris-HCl pH 8.8, 6M urea, 30% glycerol + 蛋白与 SDS 结合 甘油和尿素降低电内渗作用 ? 第一步 DTT 平衡 ： (1 x 15min) 1% DTT ? 第二步 碘乙酰胺平衡 ：去除多余的 DTT ，防止拖尾 (1 x 15min) 2.5% iodoacetamide 41 / GE Title or job number / 2/16/2020 第二向垂直电泳系统 琼脂糖覆盖密封 放置 IPG strip 低熔点琼脂糖 42 / GE Title or job number / 2/16/2020 Push the IPG Strip Down onto the Gel Surface 43 / GE Title or job number / 2/16/2020 Seal the Cassette and Fix the IPG Strip with Agarose 44 / GE Title or job number / 2/16/2020 Inserting the Cassette 45 / GE Title or job number / 2/16/2020 SDS参数 46 / GE Title or job number / 2/16/2020 SE600ruby 47 / GE Title or job number / 2/16/2020 Ettan DALT six 1 / GE Title or job number / 2/16/2020 双 向 电 泳 技 术 2 / GE Title or job number / 2/16/2020 Proteomics “ ...the analysis of complete complement of proteins . Proteomics includes not only the ident