免疫组化技术分析课件.ppt

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免疫组化的作用 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原,如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 免疫组化操作步骤 一.石蜡切片制作 1、固定:取组织,用PBS冲洗,放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h 2、脱水:倒去固定液,用蒸馏水冲洗3次,再用50%酒精冲洗2次,用酒精逐级脱水,70%酒精1天,80%酒精过夜,95%酒精3h,无水酒精(Ⅰ)、(Ⅱ)各2h 3、透明:1:1无水酒精二甲苯45min,二甲苯(Ⅰ)、(Ⅱ)各30min 4、包埋:(恒温箱内进行)浸入石蜡,1:1二甲苯石蜡(58℃)45min,石蜡(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)共2.5h,用石蜡(Ⅲ)包埋组织 5、切片:包埋后的组织块经修整后,用切片机切成5-7μm,的石蜡带 6、贴片:将组织石蜡块在50℃温水中展片,然后用处理干净的载玻片捞片,组织带可黏在载玻片上 (洗片:1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%酒精浸泡2h后擦干 → 涂胶:防脱剂多聚赖氨酸) 7、烤片:68℃恒温箱内烤片2h 二.SP(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结)三步法 1、脱蜡、水化 60 ℃×20 min→Xylene 2 ×10 minutes;60℃×20分钟→二甲苯2 × 10分钟 100% absolute ethanol:2 ×5 minutes;100%的绝对乙醇:2×5分钟; 95% ethanol 2 minutes;95%的乙醇2分钟 80% ethanol 2 minutes; 70% ethanol 2 minutes; distilled water:5 min;蒸馏水:5分钟 PBS洗3次×3 min。 2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 用封闭通透液浸润切片30 min(RT避光)。配法是用预热40 ml PBS加120ul TritonX-100(曲拉通X-100又称清洁剂)加热几分钟后,临用前加400 ul 30%H2O2。 PBS溶液洗3次×3 min。 3、抗原修复暴露抗原决定族 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)后,在微波炉里高火4 min至沸腾后,再加热约6 min×4次,每次间隔补足液体,防止干片 4、封闭非特异性蛋白 PBS溶液洗3次×3 min; 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清(与二抗来源一致)后放入湿盒中,室温30(10~30)min; 5、一抗孵育 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清,直接加入已稀释的一抗(1:250、500、1000)后,放入湿盒中室温1小时,然后4度过夜,从冰箱中取出需37 ℃复温45 min。 6、二抗孵育 将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次; 用滤纸将圆圈周围的水吸去,加入已稀释的二抗后放入37 ℃恒温烤箱中30 min(回收)。 用PBS洗5次×5 min; 7、SP反应 加入SP后放入37度烤箱中30 min。 用PBS洗5次×5 min; 8、显色 加入DAB(快速滴入,观察染色情况,倒掉染液),显色时间控制在约5 min(3~10 min),由镜下观察颜色控制时间。0.05%DAB(避光)(1:20储备液):5 ul 20×DAB+0.1 ul 30% H2O2+95 ul PBS。1%DAB储备液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解,-20 ℃保存。 9、复染、脱水、透明、封片 用PBS 3次×3min后,用双蒸水洗5 min; 加一大滴苏木素染液,胞核蛋白染几秒,胞浆或胞膜蛋白染20 s后自来水冲洗,双蒸水洗5 min,再用PBS返蓝5 min。 脱水 50% ethanol 1-2 min, 70% ethanol 1-2 min 95% ethanol 1-2 min; 95% ethanol 1-2 min; 100% absolute ethanol: (1-2) min; 100% absolute ethanol: (1-2) min。 透明:Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min 封片:中性树胶。 结果分析:每张切片选择5个高倍镜视野(400X),应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析 设备 恒温箱(水浴锅)、冰箱、切片机、载玻片和盖玻片、高压锅或微波炉、染色缸、显微镜、计算机图像分析系统 所用试剂 · 0.01 M PBS(pH 7.34 ):9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加双蒸水至1000 ml;1000 ml 0.2M

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