基因工程实验报告 4 1 最终版基因工程实验报告 4 1 最终版.pdf

《基因工程》实验报告 一、实验目的 1.学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA 的提取方法。 2.学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA 的原理和方法，检测质粒DNA 的浓度与分子量。 3.了解PCR 的基本原理，掌握PCR 的基本操作技术。 4.学习利用限制性内切酶切割DNA 的方法，并通过电泳检测酶切的效果。 5.学习DNA 重组技术中的核心步骤，DNA 片段之间的体外连接方法。 6.学习制备感受态细胞并将体外重组DNA 引入受体细胞的技术。 7.掌握利用蓝白斑筛选出转化子的方法。 二、实验原理 （1）质粒DNA 的小量制备 在碱性溶液中，双链 DNA 氢键断裂，DNA 双螺旋结构遭破坏而发生变性， 但由于质粒DNA 分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH 条件 下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒 DNA 又恢 复到原来的构型；而线性的大分子量的细菌染色体 DNA 则不能复性，与细胞碎 片、蛋白质、SDS 等形成不溶性复合物。通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA 及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA 及小分子量的RNA 则留在上清液中。 混杂的RNA 可用RNA 酶(RNaseA)消除。再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质。 （2 ）琼脂糖凝胶电泳与凝胶中DNA 的检测 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45 ℃开始形成多孔性刚性 滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA 分子在碱性环境中带负电荷， 在外加电场作用下向正极泳动。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从 而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移 速度与分子量的对数值成反比关系。 SYBR GoLd 是一种极敏感的染料。其可与DNA 分子形成SYBR GoLd -DNA 复合物，在紫外光照射下发射荧光，且荧光强度与 DNA 的含量成正比。用肉眼 观察，可检测到20pg 以上的DNA。 （3 ）PCR 扩增功能基因 1 PCR(聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA 或RNA 的方法.它包括三个基 本步骤: (1) 变性：目的双链DNA 片段在94 ℃下解链; (2) 退火：两种寡核苷酸引 物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3) 延伸：DNA 模板—引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，目的基因 序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补 的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复 制链” ，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2-4 分钟， 2-3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 （4 ）限制性酶切PCR 产物及质粒 利用限制性内切酶特异的识别DNA 特异的核苷酸序列，并切割DNA，从而 产生一定长度的DNA 片段。 （5 ）重组质粒的制备 外源DNA 分子是在DNA 连接酶的作用下，在接缓冲液系统中，其可以和经 酶切的载体分子进行连接。 （6 ）氯化钙制备和转化大肠杆菌 将细菌置于0OC 的CaCl2 低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂 层形成液晶结构，使得位于外膜的与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这 就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入 DNA，Ca2+又和 DNA 结合形成 抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。经 短暂的42OC 热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许 多间隙，导致通透性增加，DNA 分子便乘机进入细胞内。 （7 ）蓝白斑筛选重组质粒 pUC18 上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N 端146 个氨基酸的编码序列，在这个编码区中插有一个多克隆位点，且不影响正常功能， 感受态菌株带有 β-半乳糖苷酶C 端部分序列的编码信息，当 puc18 载体在正常 情况下同感受态菌株融