尿酸氧化酶在大肠杆菌中的表达纯化及活性鉴定.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，３１（４）：８３８６ ? 尿酸氧化酶在大肠杆菌中的表达、 纯化及活性鉴定 朱　蕾　王庆民　武国栋　薛彤彤　孙丽霞　王晶翼 （齐鲁制药有限公司药物研究院　济南　２５０１００） 摘要　尿酸氧化酶（ｕｒａｔｅｏｘｉｄａｓｅ，Ｕｒｉｃａｓｅ，ＥＣ．１．７．３．３）是一种能将尿酸氧化为尿囊素的蛋白酶。 合成黄曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ）尿酸氧化酶基因，构建表达载体ｐＥＴ４３．１ａ／ｕｏｘ，重组质粒经双酶切 鉴定和序列分析，证明插入序列正确，转化到大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９，菌株经诱导表达尿 酸氧化酶蛋白，目的蛋白经过超声破碎，经检测以可溶性蛋白为主；菌体经超声破碎后，上清经过 阴离子柱和阳离子柱两步纯化，得到尿酸氧化酶纯品，纯品以分光光度法进行体外酶活性测定。 结果显示：尿酸氧化酶在大肠杆菌中获得高效表达，目的蛋白占菌体总蛋白的５０％；表达产物经 过两步层析柱纯化，获得电泳扫描纯度为９５％的纯品；在体外活性测定中具有分解尿酸的能力， 在临床检测和治疗中有重要意义。 关键词　尿酸氧化酶　大肠杆菌　高效表达　纯化 中图分类号　Ｑ７８６ 　　尿酸氧化酶是生物体内嘌呤降解途径中的一种酶， 生物学活性的蛋白；国外黄曲霉尿酸氧化酶基因在酿 能催化尿酸氧化成无活性、可溶的尿囊素和过氧化氢，尿 酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中表达，尿酸氧化酶的 表达量占到了菌体总蛋白的 ［３］ 囊素是除人和猿类以外其它哺乳动物嘌呤代谢的排泄 １３％ 。 物。许多物种中均发现有尿酸氧化酶存在，但在高等哺 　　本实验中合成黄曲霉尿酸氧化酶基因，并在大肠杆 乳动物（猿和人类）体内却缺乏有生物学活性的尿酸氧 菌中高效表达，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的５０％以 化酶，而以尿酸作为嘌呤代谢的终产物。尿酸及其盐类 上，并且以可溶形式表达；纯化工艺简单，节省了成本，获 在血液中溶解度很低，如果体内嘌呤代谢紊乱，产生过量 得目的蛋白的纯度高，纯品具有生物学活性。 尿酸，或者尿酸排泄受阻，血液中尿酸浓度增高，形成高 １　材料与方法 尿酸血症，长期尿酸过高就引起痛风。在临床上，尿酸氧 化酶被用于痛风、高尿酸血症和肿瘤溶解综合症的治疗， １．１　材　料 ［１］ １．１．１　菌株和质粒　实验中所用菌株ＪＭ１０９购自华 因此尿酸氧化酶是一种重要的医药用酶 。 美公司；菌株 ＤＨ５ 为本实验室保存；所用表达载体 α 　　尿酸氧化酶在自然界广泛存在，已经发现了多种 ｐＥＴ４３．１ａ购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司。 来源的尿酸氧化酶，并对其理化性质进行了研究，发现 １．１．２　试剂　所有限制性内切酶、聚合酶、连接酶均购 天然来源的尿酸氧化酶由于受产酶条件及产酶水平的 自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；胶回收试剂盒 ＧＦＸＴＭＰＣＲＤＮＡａｎｄ 影响，而限制了其在商业化生产中的有效应用，因此， ＧｅｌＢａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ购自ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ公司；质粒 尿酸氧化酶的异源表达逐渐成为研究热点［２］。已经有