体外定向诱导胚胎干细胞为造血细胞的研究.pdf

体外定向诱导胚胎干细胞为造血细胞的研究 徐令乔春平1黄绍良李树浓1吴 旋2 中山医科大学孙逸仙纪念医院儿科1中山医科大学病理生理教研室 2第三军医大学生理教研室 【摘要】本实验采用分阶段诱导小鼠和人胚胎干细胞分化的培养体系，用流式细胞 仪、免疫组化及Wright染色鉴定细胞。探索体外定向诱导小鼠及人的胚胎干细胞为 造血细胞的方法。为胚胎干细胞来源的造血细胞应用于临床，以及研究造血细胞发育 机制奠定基础。结果表明，采用口一巯基乙醇(2一ME)可使ES细胞发育形成胚胎 体，此阶段各种细胞因子不利于胚胎体的形成。干细胞因子(SCF)、血小板生成素 (TPO)和胚胎细胞条件培养液可使胚胎体细胞发育分化为造血干／祖细胞。原代骨 髓基质细胞饲养层，SCF和IL一6可使胚胎干细胞来源的造血干／祖细胞向B淋巴 细胞系分化。采用分阶段诱导人的胚胎细胞分化，与小鼠相似，第一阶段可以形成胚 胎体，第二阶段形成CD34+的造血干／祖细胞。 【主题词】 胚胎干细胞细胞活素类造血干细胞 作饲养层。分离猴的囊胚细胞建立了猴的胚胎干细胞。1998年1月我们首次报道人胚胎干细 建立人的胚胎干细胞系。 随着对胚胎于细胞研究的深入，科学家们预言在几年后人胚胎干细胞发育为各种细胞可 应用于临床，为器官移植、损伤器官的修复提供原材料。临床需要的是单一类型的细胞或组 织．并不需要多种细胞的混合体，而目前文献报道ES细胞在体外分化发育包含有从3个胚层 来源的细胞，如：内皮细胞、造血细胞、心肌细胞、软骨等。此外，从胚胎干细胞发育为某一类型 细胞是研究分化、发育规律，尤其是基因调控很好的体外培养模型。但这需要分阶段，定向诱 导发育分化才能进行研究，尤其是不同发育阶段的基因调控需要分阶段，比较单一的细胞群才 能进行分析。为此，本研究的目的是在体外从小鼠胚胎干细胞系(ES—D3)和人受精卵分阶段 诱导发育分化为造血干细胞，为临床应用和研究造血细胞发育提供基础。 l材料与方法 1。1材料 liver)细胞均由上海维胞生物学研究所丛笑倩教授提供。 ES-功细胞和BI也(buff山rat 二116— rat anti—mouse ratanti—ITIOuse rat—humanCD34 CD34，PE—conjugatedCD38和PE—conjugated 杭州九源基因工程有限公司提供。昆明鼠由本校动物中心提供。 1．2细胞培养 ． 1．2．1ES—133细胞培养及原代小鼠胚胎成纤维细胞制备。 1．2．2 000 胎牛血清的DMEM中贴壁培养，72h后收集培养液，2 清液再经过0．22 乙醇至终浓度为0．1mmol／L，即成BRL细胞条件培液。 1．2．3原代骨髓基质细胞饲养层的制备取6～8周的昆明鼠，取其股骨，用1ml注射器冲 霉素处理1h，传人6孔或24孔塑料培养板内，加培养液备用。 1．2．4胚胎细胞条件培养液(conditionalmedium)的制备使5×104／mlEs一飚细胞在 IMDM的培养液中培养，加入15％FCS，2一砸(10-5mol／L)，3d后收集培养液，离心取上清 液，0．22肿的微孔滤膜过滤后备用。诱导ES细胞分化过程中，条件培养液的浓度一般采用 25％。 1．2．5人的胚胎千细胞的建立和培养。 1．3分阶段诱导小鼠胚胎干细胞现发育为造血细胞 SCF(50 U／m1)，TPO(100 d ng／rnl)，Epo(4 ng／m1)，IL一3(50ng／m1)，IL一6(50ng／m1)。3．5 后在倒置显微镜下观察。实验重复3次。 第二阶段：用PBS液吸打第一阶段培养形成的胚胎体(见表1第4组)，离心沉淀，胰蛋白 酶消化，吹打成单个细胞，分为3组，分别加人SCF(50