荧光共振能量转移技术课件.ppt

荧光共振能量转移技术 Fluorescence resonance energy transfer, FRET 荧光共振能量转移的基本概念与理论 受体研究技术 化学技术 免疫共沉淀 放射配基结合分析 物理技术 X-射线衍射 核磁共振 电子显微镜 这些技术 要求较大量的样品 常常只能在非生理条件下完成 很难观察到实时的（real time）分子间的反应 荧光共振能量转移技术 荧光共振能量转移技术是一种物理技术 用分子生物学技术可将待研究分子进行荧光蛋白标记并在细胞表达 研究受体-配基的相互作用 测定受体-配基相互作用的距离 测定受体亲和常数 受体二聚化 受体构象变化 该技术的最显著特点是在平衡条件下，无需分离游离配基和结合配基, 即可测定平衡常数 RBA技术需要分离游离配基和结合配基 荧光共振能量转移技术 FRET的优点 高灵敏度：现在可以用此方法在溶液中或单细胞水平研究单个受体分子 可以和许多技术结合：如显微镜、流式细胞计、共聚焦显微镜、稳态和瞬态荧光光谱，在生理条件即活细胞状态下，选择性地研究分子间的相互作用 可以从商业上得到各种荧光探剂: 用它们可以标记各种所要研究的无荧光特性的分子如配体，因而大大地开阔了研究途径 1.1 荧光与荧光光谱 分子具有不同能级：分子中的外层电子，一般处于电子的基态S0 (electronic ground state ) 的最低振动能级 吸收光能以后，它可以被激发到第一电子激发态S1的任意振动能级。这－过程发生在10-15s时间内 被激发的分子，首先释放能量回到S1的最低振动能级，此过程发生在10-12s内；然后从S1的最低振动能级回到S0的各振动能级，并以光子的形式释放能量，即发射荧光 荧光与荧光光谱 由于从S1的各振动能级回到S1的最低振动能级以非辐射过程丢失能量，所以发射的荧光（从S1的最低振动能→S0的各振动能级）总是比吸收的光能能量低。 发射的荧光光谱总是向激发光谱能量较低的方向移动，荧光光谱的峰位向激发光谱的长波方向移动。 吸收或激发时形成光谱，主要是由于分子不只是吸收单一波长的光, 而是对一定波长范围的光都有吸收，但它对不同波长的光吸收几率不同，因此形成光谱。 同样，吸收了光的分子从S1回到S0的各振动能级几率也不同，因而发射的荧光也是一个光谱即荧光光谱。 主要 荧光与荧光光谱 并不是所有的分子都能发荧光，因为某些分子吸收光能以后，以非辐射的形式如碰撞丢失激发能，因而这些分子不发荧光。 在受体研究中，如果受体或配体有一个不发荧光，则必须用荧光探剂进行标记，使其均具有荧光性质。 荧光与荧光光谱 荧光强度随时间衰减，即荧光有一定寿命 荧光强度I的衰减随时间呈现指数衰减规律 式中I(t0)为t=0时的荧光强度，I(t)为t时间的荧光强度，?为荧光寿命 当t = ? 时，I (t) = I (t0)e-1, 所以, 荧光寿命的定义是用光脉冲激发荧光物质以后，荧光强度衰减为I (t0)/e 所需要的时间 τ的长短和物质本身的性质有关，也决定于其周围环境 荧光与荧光光谱 τ与发光速率常数Kf呈反比关系，即 τ= 1/Kf, Kf越大，则τ越小 一般物质的τ为10-9s 数量级，因而测量τ时所用的脉冲时间必须小于10-9s ，在测量τ时只能用光脉冲，所用仪器为瞬态荧光光谱仪 一般荧光光谱仪用氙灯产生荧光，发出的荧光是稳定的, 因此普通所用的荧光光谱仪不能测量τ 1.2 FRET的理论基础 两种不同的发荧光分子，一个为D，另一个为A 。当D吸收激发光，使D处于激发态D*。这时如果在附近存在A，D*的激发能传给附近的A，使A处于激发态A*, A* 就会发荧光 (荧光） 这一现象称为激发能量转移或荧光共振能量转移。D为供能者（donor , D),A为受能者（acceptor, A),A发出的荧光称敏化荧光。 FRET的理论基础 Forster 详细研究了上述现象，提出了共振转移理论 两个分子的振动频率相同，可发生能量转移（就好像一个振动的音叉可引起附近另一具有相同频率的另一音叉振动一样），因此称共振能量转移 FRET产生的条件 （1）D、A都能发荧光； （2）D的发射光谱和A的激发（或吸收）光谱必须有部分重叠； （3）D和A之间的距离必须小于10nm。 FRET的理论基础 根据Forster 理论，D和A之间能量转移率KT可用下式表示