血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定崔福爱..ppt

实验二 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 层 析 技 术 1．层析法： 层析法也称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术,是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。 用色彩（chroma）和 图谱（graphs）组成 色谱一词 （Chromatography) 2. 依据：利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数等），而最终达到对物质进行分离纯化和分析鉴定的目的。 固定相—固定不动流动相—对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。 4．分类：①流动相的物理状态：气相和液相→ 气液/固，液固/液②方式：纸、薄层、柱③原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相 5．凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)①定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。 ②基本原理：固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。流动相：洗脱液 凝胶层析的基本原理 样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作垂直向下运动和不定向扩散运动→小分子可进入凝胶空内部，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶空内部，颗粒间移动，流程短，先流出→大小分子彼此分开 ③影响因素 层析柱的选择及装填： 柱大小—分离样品量 凝胶型号—分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。 洗脱液：溶解待分离物质，不变性 加样量：1%～5% 凝胶的再生 共性： *生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析 *蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷→盐析/有机溶剂沉淀 *两性电解质和等电点：pH pI，蛋白质带负电；反之带正电→电泳、离子交换层析 *有一定的功能：抗原性→ 免疫沉淀 个性：蛋白质的分子量、等电点、亲水程度、形状不同 1. 初步纯化：盐析 取血清1.0ml于小试管中，加入洗脱液 1.0mL摇匀，再逐滴加入1.0mL pH7.2饱和(NH4)2SO4溶液边加边摇。静置5min后，3000rpm/min 离心10min。倾去上清液。 将沉淀用1.0mL 洗脱液搅拌溶解，再逐滴加入0.5mL饱和(NH4)2SO4溶液， 混匀，于室温放置5min。 3000rpm/min 离心10min 。 倾去上清液。沉淀用0.3mL洗脱液溶解，即为初步纯化的γ-球蛋白溶液。 饱和(NH4)2SO4溶液边加边摇(逐滴加入！),使用小试管。 盐析的原理：蛋白质溶液中，加入高浓度中性盐，破坏蛋白质溶解的2大因素（电荷，水化膜），使其沉淀析出。 中性盐：硫酸铵，硫酸钠等 蛋白质复溶：加入低盐浓度缓冲液 控制盐溶液的浓度可以沉淀出不同的蛋白 影响因素： 温度：温度与溶解度成正比。一般室温即可,少数温度敏感型蛋白质需4℃操作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25℃比0℃时溶解度低，更易盐析。pH值：大多数蛋白质在pI时溶解度最低。pH=pI效果更好。蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐析前血清加等量生理盐水稀释，控制蛋白质含量在2.5-3.0%。 2.凝胶层析脱盐：常用透析，需时较长，最好低温。也可用葡萄糖凝胶G-25/50过柱，用时较短。固定相：sephadex G-25流动相：pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液原理同前，蛋白质大分子，硫酸铵小分子。 3.浓缩：sephadex G-25吸水，利用高分子性质。 4.鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳 蛋白质为两性电解质，有一定的等电点，在大于其等电点的溶液中带负电，在电场中向正极移动，由于各种蛋白质的分子大小与结构不同，所带表面电荷的多少不同，因而在电场中向正极移动的速度不同。