鱼类种质检验 第13部分：同工酶电泳分析 规范要求.docx

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鱼类种质检验

第13部分：同工酶电泳分析

1范围

本文件规定了鱼类同工酶电泳分析的通用方法。

本文件描述了鱼类同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的试剂与材料、仪器和设备、抽样方法和分析步骤。

本文件适用于鱼类种质鉴定与检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T18654.2鱼类种质检验第2部分：抽样方法

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4试剂和材料

除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。

4.1丙烯酰胺（Arc）。

4.2N,N-亚甲基双丙烯酰胺或甲叉双丙烯酰胺（Bis）。

4.3四甲基乙二胺（TEMED）。

4.4过硫酸胺。

4.5三羟甲基氨基甲烷（Tris）。

4.6柠檬酸。

4.7乙二胺四乙酸（EDTA）。

4.8硼酸。

4.9L-组氨酸。

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4.10乳酸或乳酸钠。

4.11DL-苹果酸。

4.12α-磷酸甘油钠。

4.13磷酸氢二钠（Na2HPO4）。

4.14二个结晶水的磷酸二氢钠（NaH2PO4?2H2O）。

4.15辅酶Ⅰ（NAD）。

4.16辅酶Ⅱ（NADP）。

4.17吩嗪甲酯硫酸盐（PMS）。

4.18氯化硝基四氮唑蓝（NBT）。

4.19山梨醇。

4.20DL-异柠檬酸三钠。

4.216-磷酸葡萄糖酸钠。

4.22α-乙酸萘酯。

4.23β-乙酸萘酯。

4.24丙酮。

4.25坚牢蓝RR盐。

4.26氨基黑10B。

4.2795%乙醇。

4.28盐酸（HCl）。

4.29氢氧化钠（NaOH）。

4.30固定液：3份乙醇，加1份冰醋酸，加1份甘油，加5份蒸馏水，混合均匀。

4.31TC制胶缓冲液：三羟甲基氨基甲烷3.0285g，用柠檬酸调至pH8.0，蒸馏水定容至1L。

4.32EBT制胶缓冲液：三羟甲基氨基甲烷5.4513g，EDTA0.2922g，用硼酸调节至pH8.6，蒸馏水定容至1L。

4.33HC制胶缓冲液：组氨酸1.9395g，柠檬酸21.014g，用5%NaOH调至pH8.2，蒸馏水定容至1L。

4.34TC电极缓冲液：三羟甲基氨基甲烷4.865g，用柠檬酸调pH至8.0，蒸馏水稀释至1L。

4.35EBT电极制胶缓冲液：三羟甲基氨基甲烷65.4g，EDTA3.51g，用硼酸调至pH8.6，蒸馏水稀释至15L。

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4.36HC电极制胶缓冲液：组氨酸1.9395g，柠檬酸21.014g，用5%NaOH调pH至8.5，蒸馏水稀释至10L。

4.37Arc.Bis液：丙烯酰胺98g，N,N-亚甲基双丙烯酰胺2g，用蒸馏水溶解并定容到500mL。

4.3825%TEMED：TEMED25mL，加入75mL蒸馏水。

4.39100mg/mL过硫酸胺：过硫酸胺0.1g，溶解于1mL蒸馏水中。

4.404%聚丙烯酰胺凝胶：Arc.Bis液13.2mL，制胶缓冲液14.7mL，蒸馏水37.5mL，25%TEMED0.3mL，10%过硫酸胺0.6mL（现配现用），在烧杯内混匀，立即用注射器将混合液灌注到凝胶模具中，聚合反应结束后，取出凝胶，放在4℃保湿盒内备用。

4.411.5mol/LTris-HCl，pH8.0：三羟甲基氨基甲烷181.71g，用HCl调至pH8.0，蒸馏水稀释至1L。

4.421.5mol/LTris-HCl，pH9.5：三羟甲基氨基甲烷181.71g，用HCl调至pH9.5，蒸馏水稀释至1L。

4.430.1mol/L磷酸缓冲液：NaH2PO4?H2O51.6g，Na2HPO414.2g，蒸馏水溶解并定容至1L。

4.44染色液：几种常见同工酶染色液的配制方法见附录A。

5仪器与设备

5.1微量匀浆机，转速4000r/min。或玻璃匀浆器。

5.2高速冷冻离心机，转速12000r/min，冷冻温度为4℃。

5.3多用电泳仪和电泳槽。

5.4激光扫描仪。

5.5pH计：精度0.01。

5.6微量加样注射器。

5.7制胶模具。

5.8染色缸。

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