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水稻秸秆纤维素发酵转化燃料乙醇的研究

摘要

我国水稻秸秆资源丰富，年产量达3亿多吨。利用水稻秸秆生产燃料乙醇，对解决未来我国能源问题、实现节粮代粮和环保有着巨大的潜力和广阔的应用前景。水稻秸秆的主要成分是纤维素，对纤维素的利用最主要的限制性因素是将纤维素转化为可发酵复原搪。

解决的方法主要有两类途径:(l)提高纤维素酶生产的经济性，主要涉及纤维素酶高产菌的获得及纤维素酶的生产技术，提高其合成效率以降低单位纤维素酶生产本钱;(2)提高纤维素酶利用效率，主要涉及纤维素酶解催化过程，以降低单位可发酵复原糖生产本钱。因此，本研究从菌种的选育着手，研究了菌株的产酶特性，用响应面策略优化发酵培养基，形成了SL发酵罐分批发酵生产高活力纤维素酶技术;别离纯化了纤维素酶;构建了代谢纤维二糖的酿酒酵母工程菌;对酿酒酵母工程菌细胞固定化发酵进行了研究，利用二级串联式生物反响器祸合系统生物协同酶解水稻秸秆发酵生产燃料乙醇等。主要研究结果如下:

1.筛选到一株纤维素酶高产菌株(PenicilliumYT01)，原生质体紫外诱变后得到突变株YT02，YT02以水稻秸秆为碳源，豆饼粉和硫酸铵为氮源，在29℃，初始pH6.0发酵12Oh，纤维素酶活力到达最高，摇瓶发酵滤纸酶活(FPA)、CMC酶活(CMcase)和p-葡萄糖苷酶活(CB)分别达3.86IU/mL、207.41IU/mL和l.4oIU/mL。

2.用响应面方法(RSM)优化的发酵培养基组成为:水稻秸秆为41.95g/l，豆饼粉为24.83g/L，麸皮为22.16g/l，困H4)2504、KHZpO4为4g/L，MgSO;为0.sg/L;起始pH6.0。

以优化的培养基发酵120h，滤纸酶活、cMc酶活和β-葡萄糖苷酶活分别到达8.8967IU/mL、357.41IU/mLand3.704IU/mL。远高于优化前的纤维素酶活水平。

3.在SL发酵罐中研究了温度、pH值和溶氧对菌体生长和产酶的影响，确定了分批发酵的工艺条件为:0一32h时发酵温度32℃，溶氧70%;32h至1加h发酵结果发酵温度29℃，溶氧50%，发酵液初始pH值6.0，发酵%h滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活分别到达11.13IU/mL、465.24IU/mLand4.08IU/mL，均高于摇瓶发酵水平，分批发酵动力学过程显示，突变菌YT02菌体生长和纤维素酶各组分均为局部祸联。

4.利用DEAEsephadexΑ-25和sephadexG-75别离纯化了二个内切葡聚糖酶(CMCase)和一个β-葡萄糖苷酶，CMCase纯化倍数为13.48，回收率为10.54%，β-葡萄糖苷酶纯化倍数为18.62，回收率为8.62%，经SDS得到单蛋白分子条带，经分子量测定分别为73kDa、43kDa和57.8kDa，并对其进行了N端测序和质谱分析。

5.以生产乙醇性能优良的酿酒酵母菌株NAN-27作为工程菌株的受体菌。利用稳定性能良好的多拷贝整合型载体pYMIKP，使纤维二糖代谢基因BGLI整合到酿酒酵母的染色体上。从而在酿酒酵母工业菌株中建立了稳定的纤维二糖代谢途径，拓展了酒精生产的底物利用范围，降低了纤维二糖对纤维素酶解的抑制作用。采用海藻酸钙凝胶包埋固定代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌，固定化细胞与游离细胞相比，发酵时间缩短，乙醇产率提高20%以上，并能有效地利用水稻秸秆水解液进行酒精发酵。

6.对水稻秸秆酶解过程中底物性质、酶解温度、酶解pH、底物浓度及纤维素酶用量等关键因子进行了研究。由于YT02纤维素酶系中纤维二搪酶活力较低(CB/F队为0.38)，经稀酸稀碱预处理后的水稻秸秆纤维素对乙醇转化率仅为18%。采用代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌游离细胞发酵，可局部去除纤维二糖对酶解的抑制，水稻秸秆纤维素对乙醇转化率可提高至20%。进一步利用采用海藻酸钙凝胶包埋固定代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌发酵，水稻秸秆纤维素对乙醇转化率可达26%。这方面的研究结果有助于深入了解纤维素酶的协同降解机制。

7.将纤维原料的酶解、固定化代谢纤维二搪酿酒酵母工程菌的作用有机祸联，构建成新型的二级串联式生物反响器，在该反响器体系的协同作用下，可有效解除纤维二糖和葡萄糖对纤维素酶的反响抑制作用，促进纤维原料水稻秸秆的酶水解，发酵40h，乙醇浓度达25.5g/l，纤维素对乙醇的转化率达43.0%(纤维素对乙醇的理论转化率为56.61%)，是游离细胞同时糖化发酵(SSF)的1.65倍，生产效率达0.64留(Lh)。采用分批添料式协同酶解发酵工艺，可提高纤维底物的终浓度达250g/L，产物乙醇的终浓度66.51g/l，有效提高了纤维素酶的利用率和乙醇生产效率，降低乙醇的生产本钱。该反响器性能稳定，反响效率高，固定化细胞可以重复使用，便于