(2.4)--[6]chapter6酶工程酶工程酶工程.ppt

1.2.1凝胶包埋法原理凝胶包埋法又称格子包埋法或者网格包埋法，其原理如图：引聚剂*将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶分散在其中，然后将其滴入凝固剂中（常用CaCl2溶液），使海藻酸钠中的Na+，部分被Ca2+所取代海藻酸钙而凝聚，凝胶即可把酶包埋。1、配制海藻酸钠溶液冷却后加入酶1.2.1海藻酸钙凝胶包埋法*1.2.1海藻酸钙凝胶包埋法将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶分散在其中，然后将其滴入凝固剂中（常用CaCl2溶液），使海藻酸钠中的Na+被Ca2+所取代生成海藻酸钙而凝聚，凝胶即可把酶包埋。2、加入引聚剂成型*底物分子产物1.2.1凝胶包埋法的适用性1、凝胶包埋法不适用底物和产物分子很大的酶的固定化。2、一般酶分子较小，容易从凝胶孔径中泄露，因此凝胶包埋法最适合细胞和原生质体的固定化法。凝胶包埋法是应用最为广泛的固定化方法。*1.2.2半透膜包埋法将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶，也叫微胶囊法。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。底物和产物通过渗透差通过半透膜微胶囊法*低分子底物、产物可以自由通过微囊孔径小于酶分子12.3包埋法的优缺点总结1、反应条件温和，比吸附法稳定；2、细胞和载体间没有束缚，不改变酶的结构可保持酶的活性；1、对分子大小有要求，要求底物产物的分子小于半透膜的孔径，酶分子大于半透膜的孔径2、比较脆弱，不耐搅拌或高流速操作。*优点缺点酶S1.3结合固定化技术选择适宜载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。根据酶与载体结合的化学键不同可分为：共价结合法离子结合法载体载体*1.3.1离子键结合法++++++++++++----------------++++++++离子键结合法通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE纤维素、凝胶。酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固相载体之间由于电荷相吸而形成离子键，使酶吸附到离子交换剂上。*1.3.2共价键结合法EEEEE共价键结合法通过化学共价键，把与酶蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水的载体上。常用载体：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等。*①首先在载体上引进活泼基团②然后活化该活泼基团③最后活泼基团与酶分子上某一基团（氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基）形成共价键1.3.3结合法的优缺点总结++++++++++++----------------++++++++离子键结合法共价键结合法酶与载体结合较牢固，不易脱落制备复杂；酶蛋白活性中心易破坏操作简便，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心不易破坏载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下酶易从载体上脱落*1.4交联固定化技术借助双功能试剂使酶分子间发生交联作用,制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。常用的双功能试剂有：戊二醛、己二胺等、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应*1.4.1交联法操作步骤先将酶吸附在不溶于水的载体上，再用双功能试剂戊二醛与酶蛋白的氨基之间交联起来，形成酶网包围在载体表面。*1.4.2交联法优缺点总结交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大。*优点缺点连连看吸附法包埋法结合法交联法方法简便、载体廉价可再生。条件温和、但结合不牢固易脱落，操作稳定性差。适用于动物细胞培养。结合牢固，反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大；机械强度高，不易再生。结合牢固，稳定性高，可连续使用。但操作复杂，易引起酶的构象或者细胞的破坏。细胞和载体间没有束缚，固定化后，细胞仍保持较高活力。适用于小分子底物以及细胞和原生质体固定化。*第二节固化酶的特性*2.1固定化酶的活性固定化的载体所带来的分配效应、空间障碍效应和扩散限制效应是影响固定化酶催化效率的主要因素。*分配效应:载体形成的微环境与宏观环境之间底物分配不同，存在底物浓度差。微环境效应微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。*2.1固定化酶的活性构象改变或立体屏蔽导致的空间障碍效应2.1固定