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发酵工艺及设备试验报告

学院：化学化工学院

专业：生物工程班级：1201学号：

学生姓名：

日期2014年11月

试验一摇瓶发酵法制备糖化酶

一试验目的

、

（1把握摇床发酵法制备糖化酶的工艺流程及操作方法

（2了解利用黑曲霉菌菌种发酵时的生长条件及留意事项

（3娴熟把握试验过程中的无菌操作和培育条件的选择

二试验仪器及试剂

、

菌种：黑曲霉

仪器：锥形瓶〔500ml)、移液管、恒温水浴锅、秒表、50mL比色管、牛皮纸、

纱布〔8层〕、pH计。

药品：三水乙酸钠、冰醋酸、硫代硫酸钠、碘、氢氧化钠、硫酸、可溶性淀粉、

玉米粉、豆饼粉、麸皮

三、试验原理

摇瓶发酵是试验室常用的通风发酵方法，通过将装有液体发酵培育基的摇瓶

放在摇床上振荡培育，以满足微生物生长、生殖及产生很多代谢产物对氧的需求。它

是试验室筛选好气性菌种，以及摸索种子培育工艺与发酵工艺的常用方法。

葡萄糖淀粉酶〔EC3.2.1.3〕系统名为淀粉α-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶，俗

称糖化酶，是国内产量最大的酶品种。糖化酶对淀粉分子的作用是从非复原末端

切开α-1,4键，也能切开α-1,3键和α-1,6键，产生葡萄糖。

糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非复原末端开头，分解α-1,4-

葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次

碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算酶活力。

四、试验步骤

1.培育步骤

1.1种子培育基制备及灭菌

将颖土豆去皮切块，称取200~300g土豆块放入500mL烧杯中，参加肯定

量水，在电炉上煮沸至土豆块熟透，用120目纱布过滤，滤渣反复用肯定量水清

洗、过滤2次，合并各次滤液且定容至1000mL即得土豆汁。取肯定体积的土豆

汁，在其中参加5%的蔗糖，溶解摇匀并调pH至5.5，即得种子培育基。将适

量种子培育基倒入锥形瓶〔250ml〕，用纱布塞塞住管口，并用牛皮纸包扎，置灭

菌锅中，于121℃下灭菌30min。待灭菌完毕，冷却取出。

1.2发酵培育基制备及灭菌

取6只500mL摇瓶，分别按装液量100、200、300mL配制培育基〔玉米粉

6%、豆饼粉2%、麸皮1%〕，加水后略微摇动，使原料潮湿，浸入水中。用8层纱

布包扎瓶口，再加牛皮纸包扎。置灭菌锅中，于121℃下灭菌30min。

1.3发酵培育基接种：将已生长好的菌种，在无菌条件下，依据10%的接

量〔8%-12%〕接种到发酵培育基上。

1.4发酵培育基发酵：将摇瓶固定在摇床上，培育温度为31℃，转速为

120r/min，培育时间96h。显微镜观看菌丝形态，用试纸测发酵液pH，测定酶活

力。摇瓶培育时观看各种摇瓶机的构造。

2.糖化酶活力测定

2.1待测酶液的制备：

准确吸取液体酶1.00mL，先用少量的乙酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，

将上清液留神倾入容量瓶中。沉渣局部再参加少量缓冲液，最终全部移入容量瓶

中，用缓冲液定容至刻度〔估量酶活力在100~250u/mL范围内〕，摇匀。通过4

层纱布过滤，滤液供测定用。

2.2酶活力测定：

于甲、乙两支50mL比色管中，分别参加可溶性淀粉溶液25mL及缓冲液5mL，

摇匀后，于40℃恒温水浴中预热5min。在甲管〔样品〕中参加待测酶液2mL，

马上摇匀，在此温度下准确反响30min，马上各参加氢氧化钠溶液0.2mL，摇匀，

将两管取出快速冷却，并于乙管〔空白〕中补加待测酶液2mL。吸取上述反响液

与空白液各5mL，分别置于碘量瓶中，准确参加碘溶液10mL，再加氢氧化钠溶液

15mL，摇匀塞紧，于暗处反响15min。取出，加硫酸溶液2mL，马上用硫代硫酸

钠标准液滴定，直至蓝色刚好消逝为其终点。

2.3酶活力计算：

样品酶活力〔u/g或u/mL〕=579.9×(A-B)c×n式中：A与B分别为空白、

样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；c为硫代硫