内含子的比较课件.pptVIP

8.5不同类型内含子的比较;8.5.1.1Ⅰ型内含子;发现过程为:

1980年,科学工作者将四膜虫rRNA基因克隆到质粒中，并与E.coli的RNA聚合酶一起保温，发现转录产物除了有约400nt的rRNA内含子外，还有一些小片段。从凝胶中回收rRNA前体，在无蛋白质的条件下保温培养，单一的rRNA前体依然可形成片段更小的电泳条带，其中移动最快的是39nt的条带，测序发现，它相当于413nt的rRNA内含子中的片段。将四膜虫26SrRNA基因的一部分(第l个外显子303bp+完整的内含子413bp+第2个外显子624bp)克隆到含噬菌体SP6启动子的载体内，再转录该重组质粒，将获得的产物与GTP一起保温，可以得到剪接产物，但缺乏GTP时无剪接反应，证明rRNA前体的确可以进行有GTP参与的自我剪接。

;8.5.1.2Ⅰ型内含子的剪接机制;5;

第三次转酯反应是线性内含子的环化，发生在已切除的内含子片段中，内含子的3-OH攻击其5-端附近的第15和第16核苷酸之间的磷酸二酯键，从5-端切除15nt的片段，并形成399nt的环状RNA。环状RNA随即被切割生成线状RNA，由于切割位置与环化位置相同，生成的线状RNA依然为399nt。接着，再从5-端切去4个核苷酸，最终产物是395nt的线性RNA，由于这一产物比最初释放的内含子少19个核苷酸，因而被称作L19。;(2)I型内含子的结构I型内含子剪接的最重要特点是自我催化(self-catalysis)，I型内含子的自我剪接活性依赖于RNA分子中的碱基配对。通过比较不同的I型内含子序列，发现其中有9个主要的碱基配对区域，命名为P1～P9，在I型内含子中高度保守的双链结构有3个，即P1的内部引导序列(internalguidesequence,IGS)，P4的保守短序列元件P/Q，和P7的保守短序列元件S/R，其他配对区的序列因内含子不同而异。I型内含子自我剪接所需的最小催化活性中心由P3、P4、P6和P7组成。该结构包括由两个结构域构成的催化核心，每个结构域由两个碱基配对区域构成。包含上游外显子末端序列和内含子端IGS的P1，构成底物结合位点，IGS是内含子中能与外显子进行碱基配对的序列，这种配对使剪接位点暴露而易受攻击，同时使剪接反应具有专一性(图8-16)。

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;I型内含子的特征

1.边界顺序为5′U……G3′;

2.具有中部核心结构??Centralcorestructure);

3.内部引导顺序(InternalguideseguenceIGS);

4.剪接通过转酯反应（Transesterification).

;8.5.2.1II型内含子的特点

II型内含子主要存在于某些真核生物的线粒体和叶绿体rRNA基因中，也具有催化功能，能够完成自我剪接.几乎所有的细菌II型内含子能够编码逆转录酶，并可作为逆转录转座子，或逆转录转座子的衍生物高频率插入特定区域，或低频率插入其它区域。II型内含子是由内含子靠近3-端的腺苷酸2-羟基攻击5-磷酸基启动剪接过程，经过两次转酯反应连接两个外显子，并切除形成套索结构的内含子(图8-17)。;11;8.5.2.2II型内含子的剪接机制

;13;在II型内含子剪接过程中，首先由内含子靠近3-端d6结构中的分支点保守序列上A的2-OH向5-剪接位点的磷酸二酯键发动亲核攻击，形成外显子1的3-OH，内含子5-端的磷酸基与分支点A的2-OH基形成2,5-磷酸二酯键，产生套索结构，完成第一次转酯反应。接着，外显子1的3-OH亲核攻击3-剪接位点，切断3-剪接位点的磷酸二酯键，并形成外显子1与外显子2之间的3,5-磷酸二酯键，完成第二次转酯反应。经过两次转酯反应，两个外显子被连接在一起，并释放含有套索结构的内含子。;II型内含子主要的转座事件是归巢(homing)，归巢的实质是以内含子RNA作为模板，将逆转录合成的DNA插入靶位点。逆转录反应由与RNA内含子结合的RT催化，属于靶位点为引物的逆转录(target-primedreversetranscription)。如图8-20所示，归巢反应开始于双链DNA外显子连接点上RNA内含子在靶位点的反拼接(reversesplicing)插入，这一步由RNA催化，RT协助，相当于由成熟酶协助的拼接反应的逆反应。随后，RT的En结构域在下游9bp～10bp的位置切开DNA的另一条链，再由RT催化，以被切开的DNA链作为引物进行逆转录反应。最后，通过DNA的修复合成和连接完成内含子的插入过程。;16;Splicingreleasesamitochondrialgroup