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LAMP微流控芯片即时检测骨髓增殖性肿瘤分子标志物

JAK2V617F、MPLW515K/L的研究

复旦大学附属华山医院

关明

研究背景-骨髓增殖性肿瘤

n骨髓增殖性肿瘤（MPN）：慢性粒细胞白血病（CML）、真性红细胞增

多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）、原发性骨髓纤维化（PMF）

n临床困扰的问题:经典MPN（PV,ET和PMF）之间可互相转化或合并存

在，不同类型的MPN与反应性增生之间的鉴别诊断困难。

nPVnETnPMF

MPN诊断革命性的突破-分子标志物的发现

nWHO：JAK2V617F和MPLW515K/L基因突变列入PV、ET、PMF的诊

断标准之一。

nJAK2V617F：JAK2基因14外显子1849位碱基GT点突变,PV95%，

ET/PMF50%-60%。

nMPLW515K/L:MPL基因10号外显子515位密码子色氨酸TGG替换为赖

氨酸AAG(515K)/亮氨酸TTG(515L)，ET/PMF5%～10%。

梅奥诊所制定经典MPN分子诊断的路径

n临床医生能有序使用这两种分子指标

n避免昂贵的检测费用

n联合检测意义重大

l明确MPN诊断

l有助于MPN治疗及预后

l脑卒中的社区筛查

骨髓增殖性肿瘤与缺血性卒中

nMPN是脑卒中的病因之一，部分患者在诊断为MPN之前，就因

发生血栓导致急性缺血性脑卒中。

nJAK2V617F突变阳性为MPN患者脑血栓形成的独立预测因子，

血栓形成是MPN患者死亡主要原因。

nJAK2V617F突变的检测有助于判定脑血管事件风险。

n专家建议在社区开展脑卒中MPN分子标志物筛查。

社区筛查亟需建立MPN分子标志物POCT方法

n社区筛查：急性缺血性脑卒中患者早治疗，减少血栓并发症。

n基因突变检测方法：PCR，测序。

n即时检验（POCT)：现场、便携和快速。

研究目的

n建立即时检测JAK2V617F、MPLW515K/L基因突变新方

法，以实现对MPN的早期诊断，为脑卒中患者提供MPN分

子标志物的社区筛查手段。

研究方法-微流控芯片结合等温扩增技术

n微流控芯片(Microchip)：实验室的功能集成在几平方厘米芯片上，可

集成化、便于携带。

Labonchip

n环介导等温扩增(LAMP)：快速、灵敏度高,特异性强、操作方便。

nMicrochip-LAMP可摆脱对精良仪器设备及精确温度的依赖

研究内容

n单位点基因突变检测微流控芯片的研制及其即时检测

JAK2V617F突变的应用。

n多位点基因突变检测微流控芯片的研制及其在即时检测

JAK2V617F，MPLW515K/L突变的应用。

第一部分

单位点基因突变检测微流控芯片的研制及其即时检测

JAK2V617F突变的应用

技术路线

研究方法与结果-引物设计

nJAK2V617F野生型引物：F3-W，B3-W，FIP-W,BIP-W，P-W,PNA-M

nJAK2V617F突变型引物：F3-M，B3-M，FIP-M,BIP-M，P-M,PNA-W

研究方法与结果-荧光染料钙黄绿素

n反应前加入LAMP反应体系，一步反应后无需开盖，可根据是否有肉眼可

见绿色荧光准确判断反应结果。