实验八聚炳烯凝胶电泳.ppt

关于实验八聚炳烯凝胶电泳一、实验目的学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术第2页,共31页，2024年2月25日，星期天二.基本原理(一)电泳电泳:带电颗粒在电场的作用下,向着与其电性相反的电极移动的现象.(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳用丙烯酰胺(Acr)单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合成的多孔介质.以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。第3页,共31页，2024年2月25日，星期天1.聚丙烯酰胺凝胶有下列特性(1)凝胶有弹性，机械性能好；几乎无吸附和电渗作用，样品分离重复性好；(2)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度较高。(3)凝胶孔径可调节，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(4)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。第4页,共31页，2024年2月25日，星期天分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)?104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 蛋白分子量范围与凝胶浓度的关系2.凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关 第5页,共31页，2024年2月25日，星期天3凝胶聚合催化体系（1）光催化：核黄素

（2）化学催化：AP-TEMED催化体系第6页,共31页，2024年2月25日，星期天Bis将单体长链间连成网状结构第7页,共31页，2024年2月25日，星期天化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响：?催化剂和加速剂的浓度?pH碱性条件?温度?分子氧?杂质第8页,共31页，2024年2月25日，星期天4.聚丙烯酰胺凝胶种类(1)连续系统与不连续系统两大类不连续系统:是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。第9页,共31页，2024年2月25日，星期天(2)不连续体系:电极缓冲液、浓缩胶及分离胶浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。第10页,共31页，2024年2月25日，星期天1)样品浓缩效应A.凝胶孔径不连续性B.缓冲体系离子成分及pH值的不连续性C.电位梯度的不连续性2)分子筛效应3)电荷效应(3)不连续体系凝胶对蛋白的分离作用第11页,共31页，2024年2月25日，星期天三.实验器材1、电泳仪,电泳槽及其附件2、培养皿3、摇床4、烧杯5、移液管6、微量进样器7、针管第12页,共31页，2024年2月25日，星期天电泳装置电泳仪：提供直流电在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移第13页,共31页，2024年2月25日，星期天垂直平板电泳槽每组（3人）做一板胶，前后可安置两副板，两组共用一套电泳装置。第14页,共31页，2024年2月25日，星期天四.实验试剂人血清；分离胶缓冲液：Tris-HCl缓冲液PH8.9；浓缩胶缓冲液:Tris-HCl缓冲液PH6.7；分离胶贮液:Acr28.0g,Bis0.735g,无离子水溶解定容至100ml；浓缩胶贮液:Acr10.0g,Bis2.5g,无离子水溶解定容至100ml；过硫酸铵溶液（AP）电泳缓冲液:Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3；固定染色液脱色液第15页,共31页，2024年2月25日，星期天(一)垂直平板电泳槽的安装(二)凝胶的制备(三)加样(四)电泳(五)固定和染色(六)脱色五.操作步骤第16页,共31页，2024年2月25日，星期天五.操作步骤(一).垂直平板电泳槽的安装注意短玻璃板是向内侧的。第17页,共3