干细胞研究方法及进展.ppt

Martinez-serrano建立了含有神经生长因子（NGF）基因的永生化神经干细胞系，这些细胞不但能在体外分泌NGF，在移植到动物脑内后，同样能表达NGF，并对其周围胆碱能神经元有促生作用。这为治疗神经退行性疾病提供了可能的方法。第159页,共161页，2024年2月25日，星期天第160页,共161页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第161页,共161页，2024年2月25日，星期天干细胞的分离与纯化1.借助细胞的生化特征及物理特性，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。2.干细胞的理化特征与其分化调控有关，如上皮干细胞高表达β1整合素，介导干细胞与细胞外基质粘附，抑制干细胞分化。第127页,共161页，2024年2月25日，星期天胚胎干细胞的分化潜能胚胎干细胞是全能(多能)性干细胞，具有分化为各种组织细胞的潜能。移植实验:人胚胎干细胞小鼠体内畸胎瘤(良性)→有三个胚层产生的组织：胃上皮(内胚层)骨、软骨、平滑肌、横纹肌等(中胚层)神经表皮、神经节复层磷状上皮等(外胚层)第128页,共161页，2024年2月25日，星期天骨髓干细胞第129页,共161页，2024年2月25日，星期天骨髓基质干细胞（MSC）的有关基础研究及应用现状MSC具备干细胞的两个重要特征:强的自我增殖能力和多分化潜能。具有向骨、软骨、脂肪、肌肉(心肌)及神经细胞等组织分化的潜能。MSC起源于中胚层,理论上讲,它应可以向其它中胚层组织分化。第130页,共161页，2024年2月25日，星期天MSC的培养方法目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。

第131页,共161页，2024年2月25日，星期天1999年,Pittenger等用地塞米松、β-甘油磷酸等在体外培养条件下将其诱导分化成骨组织;在培养体系中加入ＴＧＦ-3即可促使ＭＳＣ向软骨分化;用1-methyl-3-isobutylxanthine、地塞米松、胰岛素及消炎痛处理,可成功诱导分化为细胞内出现富集的脂质小泡的脂肪细胞。第132页,共161页，2024年2月25日，星期天Ｍakino等在小鼠骨髓细胞中加入5-azacytidine培养24ｈ,然后显微镜下分离能自发跳动的细胞克隆。分离的细胞再加入5-azacytidine培养24ｈ,筛选出自发跳动频率最高的细胞约占细胞总数的30%。电子显微镜下细胞类似于心肌细胞,包括典型的肌小节,位于细胞中央的细胞核,而且这些细胞能分泌心房利钠肽和脑利钠肽。应用单克隆抗体免疫组化的方法分析细胞的肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链、肌动蛋白后发现这些细胞类似于胚胎心肌细胞。第133页,共161页，2024年2月25日，星期天国内项鹏等首次用硫代甘油和丹参注射液诱导人ＭＳＣ分化为神经元样细胞,表达神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白。第134页,共161页，2024年2月25日，星期天近期研究表明，在适宜的体内或体外环境下MSC不仅可以分化为中胚层的间质组织，还保持有内外胚层的分化潜能，可分化为神经细胞、肺脏、上皮等。将MSC与胎鼠的中脑或纹状体细胞共同培养，它可分化为神经元和胶质细胞，而将MSC移植到心肌缺血坏死区周围，3周后渐与周围心肌细胞相似，并可见大量新生血管在新生心肌细胞周围，这些均表明MSC的分化趋势与周围微环境密切相关。因此有人推论MSC的分化由特殊转录因子决定，不同的诱导条件可以决定其分化方向，可能是这些诱导条件启动了决定分化方向的转录因子。第135页,共161页，2024年2月25日，星期天MSC的体外诱导分化亦印证了以上说法。Sanchez-Ramous发现表皮生长因子或脑源性神经营养因子可诱导人及小鼠的少数MSC分化为神经元样及神经胶质细胞。Deng等研究证明，用能提高细胞内cAMP浓度的诱导剂，如异丁甲基黄嘌呤、二丁酰基cAMP等处理后6d,大约25%的MSC定向分化为神经元样细胞，并且分化是不可逆的。第136页,共161页，2024年2月25日，星期天研究证明，MSCs在不同的体外环境诱导下可向不同组织分化。目前诱导分化的方法可大致分为两种：一是在