激光扫描共聚焦显微镜技术(共69张课件).pptxVIP

激光扫描共聚焦显微镜技术;LaserScanningConfocalMicroscope;使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61λ/NA）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。;;FluorescentMicroscope;;Differencesbetweenconventionalandconfocalmicroscope;共聚焦显微镜一次只有样品的小部分区域被照明，而普通荧光显微镜则有更宽的区域被照明。;;2、共焦显微镜发展历史;;3、显微镜成像清晰度的决定因素:;1）、分辨率：

指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离来表示。;人眼及各类显微镜的分辨率;2）、球差：

是由于透镜不能把近轴光线和远轴光线在光轴上共聚焦，以至透过标本一点的光线，在通过透镜时不能聚焦成一点,而是形成一个光斑,从而使成像模糊不清。;3）、色差：

是由于显微镜透镜类似于三棱镜,对不同颜色的光线具有不同的折射率。所以光线透过透镜后,不同色的光聚焦在不同点上,从而使成像模糊,而且像的边缘尚带有色晕。;4、激光扫描共聚焦显微镜基本结构;激光共聚焦显微镜构成;1;（1）扫描模块

;（2）荧光显微镜系统

;;（3）常用激光器

;UV激光器（紫外激光器）：351nm、364nm（紫外光);激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理是首先由激光器发射的一定波长的激发光，光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光栏形成点光源，由物镜聚焦于样品的焦平面上，样品上相应的被照射点受激发而发射出的荧光，通过检测孔光栏后，到达检测器，并成像于计算机监视屏上。这样由焦平面上样品的的每一点的荧光图像组成了一幅完整的共焦图像，称为光切片;

从某种意义上讲，共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜，它对传统的光镜从以下几方面作了改进

;1）、光源

用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。

2）、采用了共扼聚焦技术

在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。

;共扼聚焦原理图;;;;

;3）、点与面扫描技术

共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。

普通光镜：是在可见光源下一次性成像。;

Z

;4）、图像信号及处理：

光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。

计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。;5、共焦显微镜与传统显微镜的区别

1）.抑制图像的模糊，获得清晰的图像

;

2）.具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片;3）.增加侧向分辨率

;

4）.由于点对点扫描去除了杂散光的影响

;

1）.点照明

2）.具有照明pinhole和探测pinhole

3）.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦),共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面

4）.具有扫描系统——逐点扫描成像

5）.具有多个（四个）荧光通道，可同时探测多个被标记物

;1）.xy分辨率比传统显微镜小

传统显微镜?/NA（0.25?m)

Confocal:?/NA（0.18?m)

2）.样品的最大厚度:

取决于:物镜的NA、物镜的工作距离

激光的穿透力、样品的透明度

Z轴的最大移动范围(166?m、Z-wide)

3）.样品的最小光切厚度:(载物台最小移动距离为40nm）

取决于:物镜的NA、针孔大小

Z轴的最小移动步距:40nm

Z轴的分辨率:0.35?m

;激光扫描共聚焦显微镜观察。

61λ/NA）。

2）、球差：

是由于透镜不能把近轴光线和远轴光线在光轴上共聚焦，以至透过标本一点的光线，在通过透镜时不能聚焦成一点,而是形成一个光斑,从而使成像模糊不清。

Z扫描切片的3-D