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单克隆抗体制备实验过程

Preparedon22November

单 克 隆 抗 体 制 备 实 验 过 程

一、免疫动物

免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。普通选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制订的免疫方案进行免疫注射。

抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激对应B淋巴细胞克隆

，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

阐明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。上表中第四种免疫办法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。

PS：1、普通皮下注射每个注射点注射30-

50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。

2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易造成小鼠脾脏与腹膜粘连的状况

，造成后期取出脾脏麻烦。

3、冲击免疫完毕后，应在96小时内完毕细胞融合，否则对应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。

二、细胞融合（Cellfusion）

【材料和试剂】

（ 1） 骨 髓 瘤 细 胞 悬 液

选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长久细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。

（ 2） 免 疫 小 鼠 脾 细 胞 悬 液

取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周边的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完

全培养液中，计活细胞数，普通一只小鼠可得～2×108个脾细胞。

（ 3） 喂 养 细 胞

将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随即吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5mlHAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数成果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×105/ml，备用。

（4）重要试剂的配制

①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基重要有RPMI-1640或DMEM（DulbercoModifiedEaglesMedium）两种基础培养基，配好后过滤除菌（），分装，4℃保存。

不完全RPMI-1640培养基：

RPMI-1640培养基原液

96ml

100×.溶液

1ml

双抗溶液

1ml

%NaHCO3溶液

1-2ml

HEPES溶液

1ml

不完全DMEM培养基：

DMEM

超纯水或四蒸水

980ml

NaHCO3

双抗溶液

10ml

100×.溶液

10ml

用1NHCl调试PH至，过滤除菌，分装4℃保存。

完全RPMI-1640或DMEM培养基：

不完全RPMI-1640或DMEM培养基

80ml

小牛血清

15-20ml

HT或HAT培养基：

HT培养基

HAT培养基

完全RPMI-1640或DMEM培养基

99ml

98ml

HT贮存液

1ml

1ml

A贮存液

1ml

②氨基喋呤（A）贮存液（100×，4×10-5mol/L）

称取氨基喋呤（AminopterinMW），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/LNaOH中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。

③次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液（100×，H：10-2mol/L，T：×10-

3mol/L）

称取次黄嘌呤（Hypoxanthine，MW）和胸腺嘧啶核苷（Thymidine，MW

），加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-

20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。

④L-谷氨酰胺（.）溶液（100×，L）称取L-谷氨酰胺（L-glutamine，MW

），用100ml不完全培养液或超纯水（或四蒸水）溶解，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。

⑤青、链霉素（双抗）溶液（100×）

取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素