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蛋白真核表达载体的构建方法 实验目的 构建真核表达载体，用于蛋白的真核表达。 实验原理 将克隆基因插入合适的载体后导入到真核细胞中用于表达大量蛋白 质的方法。在蛋白质纯化、定位及功能分析等方面都有应用。 实验试剂 Tag DNA 聚合酶、DNA Marker DL2000 及 DNA Marker DL15000 (TaKaRa) ； Pfu高保真酶(Stratagene) ； T4 DNA 连接酶、EcoR I、 BanHI和Hind III限制性内切酶(Fermentas) ；E.Z.N.A. Gel Extraction Kit> Plasmid Mini Kit (Omega)；抗生素(BBI)；蛋白豚和酵母提取物 (OXOID ) o LB固体培养基(低盐)：在LB液体培养基中加入1.5%琼脂粉，在 121℃高压下蒸气灭菌20 min。待培养基温度降至50℃左右，加入相应 的抗生素后，铺制平板，待培养基凝固后，倒放置于4c保存备用。 LB液体培养基(低盐)：将胰蛋白陈(Tryptone) 10 g,酵母浸出 物(Yeast Extract) 5 g, NaCl 5 g,溶于适量去离子水中，完全溶解后用 5moi/LNaOH调pH值至7.0?7.2,定容至1000mL,在121℃高压下灭菌20 min,室温保存。 氨苇青霉素(Ampicillin, Amp)：用灭菌去离子水配成贮存浓度 50 mg/mL, -20℃ 分装备用。 感受态细胞制备试剂，0.1 mol/LCaCb溶液：取27 g CaCLFfhO溶于 去离子水中并定容至1000 mL,过滤除菌，分装后置-20C保存，用于大 肠杆菌感受态细胞的制备。 实验材料 InGenius Bio Imaging凝胶成像及分析系统(Gyndene) ；Zentrifugen Rotofix 32离心机(美国Hettich公司产品)；ElixlOO纯净水装置 (Millipore) ； PTC-200型PCR仪(MJReSearch) ； PowerPacTM基石出电 泳仪(BIO-RAD) ； LRH-250n型生化培养箱；Rotina 35R低温水平离 心机(Hettich) ； Model550型酶标仪(BIO-RAD)。 操作步骤 (一)目的基因扩增 Premix Ex Taq上游引物Fl (20 Premix Ex Taq 上游引物Fl (20处＜) 下游引物F2 (20|iM) 模版DNA 25 pL 0.5 |nL 0.5 pL 2.5(liL 21.5|liL50 pL去离子水 21.5|liL 50 pL 总体积 94℃预变性4 111皿；94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 35s ,进行30个循环, 最后72℃延伸10 min, 4℃保存。 扩增后用1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。 (二)PCR产物的回收 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，在长波紫外灯下，用干净刀片 将所需回收的DNA条带切下，尽量切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体 积越小越好；然后使用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。具体步骤如下: (1)将切下的凝胶放入2 mL离心管，称重记录重量，按照每1g凝胶加 入1mL溶胶液对应量，加入适量体积的溶胶液，50?65。(：水浴至凝胶完 全溶解，每隔2?3 min振荡一次； (2)把HiBindDNA柱子套在2 mL收集管，加入500g的BL平衡液， 10000 rpm离心 1 min,弃液; (3)将DNA凝胶混合液转移至上述柱子中，10000 rpm离心1 min,倒 去滤液，若混合液多，可分次上柱，每次转移700)iL； (4)加入600 |1L PW漂洗液,10000 rpm离心1 min,倒去滤液； (5)重复上一步； (6)上述柱子，12000 rpm离心空柱2 min,室温静置5 min,是柱子彻 底干燥； (7)把柱子装在干净的1.5 mL离心管上，加入30?50|iLddH2。,室温 静置2 min, 12000 rpm离心2 min洗脱出DNA。可重复一次以提高产量。 (三)连接克隆载体 参照Tarkara公司pMD19-T Vector的使用说明书进行。连接反应体 系(10pL),混匀后，置PCR仪16℃作用4h以上，-20C保存。 载体连接反应体系： 总体积 10|dL 2xLigase Buffer (Ligation Solution I) 5 rL PCR纯化产物 4.5 |nL pMD19-T Vector 0.5 pL (四)连接产物的转化 转化用的感受态细胞为大肠杆菌的DH5a菌株，具体步骤如下： (1)取感受态细胞置于冰上，轻弹管壁使其混匀； (2)无菌条件下，5匹连接产物加入到50四融化的感受态细胞中