人快速型肌球蛋白结合蛋白C原核表达载体的构建及表达纯化.docx

人快速型肌球蛋白结合蛋白C原核表达载体的构建及表达纯冯利强;刘幸卉;陈荣;曾慧君;黄维一;廖华【摘要】目的构建人快速型肌球蛋白结合蛋白C(MyBP-C2)融合蛋白表达载体，高效表达和纯化pET28a-MyBPC2融合蛋白，为进一步研究MyBP-C2的生物学功能提供基础.方法PCR扩增MyBP-C2基因片段，经双酶切定向克隆至表达载体pET28a,构建原核重组表达载体pET28a-MyBPC2,通过酶切和测序鉴定后，导入E.coliBL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白，经层析纯化、透析复性,SDS分析鉴定.结果经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pET28a-MyBPC2,诱导后的融合蛋白经SDS检测到分子量正确的特异性蛋白条带，经纯化后得到了浓度为0.72g?L-1的融合蛋白4.52mg.结论MyBP-C2表达载体构建成功，为研究人肌球蛋白结合蛋白C的生物学功能以及诱导建立新型实验性自身免疫性肌炎的动物模型奠定了基础. 【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷)，期】2015(037)008【总页数】6页(P865-868,873,封4)【关键词】人MyBP-C2基因;基因克隆;融合蛋白;原核表达【作者】冯利强浏幸卉;陈荣;曾慧君;黄维一;廖华【作者单位】南方医科大学基础医学院解剖教研室，广东省组织构建与检测重点实验室广州510515;宁夏医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，银川 750004浦方医科大学基础医学院解剖教研室广东省组织构建与检测重点实验室,广州510515;南方医科大学基础医学院解剖教研室，广东省组织构建与检测重点实验室广州510515浦方医科大学基础医学院解剖教研室广东省组织构建与检测重点实验室广州510515浦方医科大学基础医学院解剖教研室广东省组织构建与检测重点实验室广州510515浦方医科大学基础医学院解剖教研室广东省组织构建与检测重点实验室，广州I510515【正文语种】中文【中图分类】Q813通信作者：廖华，教授，博士生导师，从事骨骼肌损伤相关研究。 E-mail: 多发性肌炎(polymyositis,PM)是一种慢性自身免疫性肌炎，其主要影响横纹肌。 肌肉损伤导致不同程度的肌力减弱，在PM的急重性病例中甚至可出现呼吸肌力减弱引发窒息或突发吞咽困难。目前，实验性自身免疫性肌炎(experimentalautoimmunemyositis,EAM)小鼠模型是研究PM病理机制的主要手段。由于诱发炎性肌病的自身抗原至今仍不清楚，以往的EAM模型制备多采用异种来源的骨骼肌组织匀浆液或部分纯化的肌球蛋白(myosin)进行体内免疫，诱发小鼠骨骼肌炎症。但依照上述方法制备的EAM模型小鼠的肌内炎性渗出以+T细胞为特征，而CD8+T细胞炎性渗出为特征的肌炎小鼠模型更符合多发性肌炎的病理特征 。近期有研究者采用纯化的肌球蛋白结合蛋白C伴以百日咳毒素、弗氏佐剂皮内免疫，诱发获得以CD8+T细胞为炎性渗出特征的实验性自身免疫性肌炎小鼠模型 ，但国内尚无此方面的研究报道。我们尝试用肌球蛋白结合蛋白。替代骨骼肌组织匀浆液、纯化的肌球蛋白，期望获得CD8 +T细胞炎性渗出为特征的EAM小鼠模型，因此本研究构建了人快速型肌球蛋白结合蛋白C(MyBP-C2)原核表达载体(pET28a- MyBPC2)，并纯化制备得到融合蛋白，为研究人快速型肌球蛋白结合蛋白C的生物学功能以及诱导建立新型实验性自身免疫性肌炎的动物模型奠定了基础。 1.1材料弓物由上海生工合成，TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶BamHI和 XhoI、IPTG购于TaKaRa公司，DNA凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、低分子量蛋白Marker购自广州东盛生物科技公司，Ni-NTAbeads购于金斯瑞公司，透析袋、内毒素去除凝胶购于Thermo公司，到华大基因公司测序。原核表达载体pET28a、宿主菌E. coliDH5a、E. coliBL21(DE3)购自东盛生物。 1.2MyBP-C2基因的扩增参照GeneBank收录的人骨骼肌快速型肌球蛋白结合蛋白C(MyBP-C2)的基因序列，应用PrimerPremier5.0设计MyBP-C2蛋白编码基因的PCR引物,并在5'端引入BamHI酶切位点，3'端引入XhoI酶切位点。上游引物MyBP-C2BamHIF:5'-CGCGGATCCGACCTGACCCTCAAGTGGTTCAAG-3',下游引物MyBP-C2XhoIR:5'-CCG CTCGAGCTTCAGCCAGGTAGCGACGGG-3'。以人骨骼肌cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系：2.5mMdNTPmixture2pL,5xPCRbuffer5pL，模板0.3",上下游引物各2.5pL,TaqDNA聚合酶0.3"，去离子